右美托咪定對氯胺酮致發育期大鼠神經損傷的影響

張志恒，白 薈，申美倫，馬相影，李柔茜，金簫笛，高 利

(東北農業大學動物醫學學院 黑龍江省實驗動物與比較醫學重點實驗室，哈爾濱 150030)

嚙齒和非人靈長類動物在發育期使用麻醉藥、鎮靜藥會引起神經元和膠質細胞凋亡增多，導致神經發生、突觸傳遞及脂質代謝發生異常，這也可能與其晚年的認知和行為異常有關[1]。在發育關鍵期對幼齡動物進行長時間(大于6 h)單次麻醉或較短時間多次麻醉可能會對機體產生影響[2]。氯胺酮是一種非競爭性N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體拮抗劑，麻醉效果良好且起效快，對于急慢性疼痛的動物均有效[3-5]。氯胺酮能夠引起未成熟或幼齡動物神經細胞凋亡并導致認知功能障礙，且呈現時間和劑量依賴性[6]。單次或低劑量給予氯胺酮不會引起發育期大鼠神經細胞結構及功能的改變，而高劑量重復注射或延長暴露時間便會觀察到神經細胞的退變[7]。Slikker等[8]將氯胺酮肌注到妊娠122 d、5日齡 及35日齡的恒河猴中，幼齡組均產生了神經毒性。在非人靈長類動物中的這種暴露與腦部發育異常、認知功能下降有關[9]。

尋求更安全有效的麻醉方式至關重要，如何降低氯胺酮對發育期動物的毒性引起了廣泛關注。對于幼齡動物而言，理想的麻醉藥應具備以下特點：起效迅速、作用持續時間短、給藥途徑簡單、副作用小及鎮痛效果良好[10]。右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)是一種α2-腎上腺素受體激動劑，在獸醫臨床實踐中具有良好的鎮靜、鎮痛和抗焦慮作用，且無呼吸抑制作用，但可引起副交感神經興奮、心動過緩和低血壓。右美托咪定和氯胺酮具有互補的藥理作用。右美托咪定可降低氯胺酮麻醉引起的心血管及精神方面的不良反應[11]。氯胺酮和右美托咪定的組合可產生有效的鎮靜作用，使動物的誘導麻醉更平穩，并可有效降低圍手術期不良事件的發生率[12]。但其對發育期動物的神經毒性和安全性還需要進行更深入的研究證實。因此，本研究通過構建氯胺酮致發育期大鼠神經毒性模型，使用右美托咪定進行干預,探究右美托咪定對氯胺酮致發育期大鼠氧化應激及認知功能障礙的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

7日齡SD大鼠48只，來源為哈爾濱醫科大學實驗動物中心。

1.2 試劑

氯胺酮由東北農業大學動物醫學學院臨床外科教研室提供；右美托咪定購自碩騰公司； 氧化應激試劑盒CAT、GSH購于南京建成生物工程研究所；MDA、GHS-Px和蛋白濃度檢測試劑盒購于碧云天生物技術公司。ELISA試劑盒IL-1β和IL-18購于慧嘉生物科技有限公司。

1.3 動物分組和藥物處理

根據先前報道的試驗方案[13]建立持續暴露氯胺酮致幼鼠神經毒性模型。7日齡SD大鼠腹腔注射20 mg·kg-1氯胺酮，每隔90 min 1次，共注射5次 (麻醉時間共7.5 h)。7日齡SD大鼠隨機分為Con組(對照組，腹腔注射生理鹽水)、Ket組[氯胺酮組，腹腔注射20 mg·kg-1氯胺酮(每1.5 h注射1次，共5次)]、Dex組(腹腔注射15 μg·kg-1Dex)、Ket+Dex組(氯胺酮注射前30 min，腹腔注射15 μg·kg-1Dex)。每次給藥0.1 mL，氯胺酮和Dex均使用生理鹽水溶解，生理鹽水和Dex提前30 min 腹腔注射。

1.4 樣本采集及保存

動物最后1次給藥1.5 h后，隨機分為兩部分：一部分動物分離海馬和皮質組織，-80 ℃保存，用于試劑盒指標檢測；另一部分使用4%多聚甲醛進行心灌流并固定保存，用于制作腦組織尼氏染色切片。

1.5 海馬神經元結構觀察

通過尼氏染色法檢測右美托咪定對氯胺酮作用下海馬神經元的影響。取4%多聚甲醛固定的腦組織樣本，修整固定后進行如下操作：生理鹽水沖洗；不同濃度梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，修形，切片(厚度5 μm)及尼氏染色，并使用中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察染色后切片。

1.6 氧化應激檢測

使用試劑盒檢測各組腦樣本中谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)的含量。評價Dex對氯胺酮致海馬組織損傷后氧化應激水平的影響。所有操作均按照試劑盒說明書進行。

1.7 數據分析

2 結 果

2.1 Dex對7日齡大鼠海馬及皮質神經元的影響

尼氏染色結果如圖1所示，與對照組相比，K組海馬CA1區和CA3區域神經元密度明顯下降，數量減少；海馬和前額葉皮質區域尼氏小體數目減少，神經元細胞結構被破壞，Ket組CA1區神經元軸突排列混亂；DG區域變化不明顯。以上結果提示,7日齡SD大鼠連續給予氯胺酮麻醉后腦區出現細胞損傷。而Ket+Dex組與Ket組相比，氯胺酮造成的神經元損傷被美托咪定預先用藥所緩解。

圖1 大腦皮質及海馬尼氏染色(400×)Fig.1 Nissl staining in the cerebrum and the hippocampus (400×)

2.2 Dex對7日齡大鼠海馬及皮質氧化應激水平的影響

如圖2、3所示，Ket組大鼠皮質和海馬中GSH含量與Con組相比顯著降低(P<0.05)，MDA含量均顯著升高(P<0.05)，CAT含量顯著下降(P<0.05)；Ket+Dex組海馬和皮質組織GSH和CAT的含量與Ket組相比均顯著升高，而MDA含量顯著降低(P<0.05)；此外，Dex組海馬和皮質組織GSH、CAT和MDA含量與Con組相比無明顯差異(P>0.05)，不具有統計學意義。

2.3 Dex對7日齡大鼠海馬及皮質炎癥因子IL-1β和IL-18的影響

如圖4、5所示，Ket組大鼠皮質和海馬中炎癥因子IL-1β和IL-18的濃度與Con組相比顯著升高(P<0.05)， Ket+Dex組海馬和皮質組織中IL-1β和IL-18與Ket組相比均顯著降低(P<0.05)；此外，Dex組海馬和皮質組織炎癥因子IL-1β和IL-18 含量與Con組無明顯差異(P>0.05)，不具有統計學意義。

Con.對照組；Dex.右美托咪定組；Ket.氯胺酮組; Ket+Dex.氯胺酮+右美托咪定組。與對照組比較，*.P<0.05；與氯胺酮組比較，#.P<0.05。下同Con.Control group; Dex.Dexmedetomidine group; Ket. Ketamine group; Ket+Dex. Ketamine+dexmedetomidine group. Compared with the control group, * .P<0.05.Compared with ketamine group, #. P<0.05.The same as below圖2 大鼠海馬中GSH、CAT和MDA的變化Fig.2 Changes of GSH, CAT and MDA in rat hippocampus

圖3 大鼠大腦皮質GSH、CAT和MDA的變化Fig.3 Changes of GSH, CAT and MDA in cerebral cortex of rat

3 討 論

大量研究表明[9, 14-16]，大多數鎮靜、鎮痛藥物都會造成發育期哺乳動物大腦神經元凋亡或者產生退行性病變。并且長期或多次暴露于麻醉時，這種變化表現得尤為顯著。麻醉藥物對于發育期動物的大腦神經毒性的產生機制及如何采取有效措施干預這一過程仍然是亟待解決的問題。右美托咪定是一種高選擇性α2受體激動劑，可提供鎮痛和類似自然睡眠的鎮靜作用，常作為獸醫臨床診療中的鎮靜鎮痛藥物。右美托咪定能夠通過減弱中樞或外周交感神經末梢去甲腎上腺素的釋放發揮交感神經阻滯作用[17-18]。右美托咪定可單獨或與咪達唑侖、氯胺酮、丙泊酚和氯丙嗪聯合用于動物的鎮靜以及各種侵入性/非侵入性手術的麻醉[18]。右美托咪定作用的α2受體廣泛存在于肝、肺、腎和大腦等器官中。此外，有研究顯示，右美托咪定具有良好的神經保護作用，可降低大腦血流量減輕哺乳動物和人的細胞凋亡、兒茶酚胺和谷氨酸釋放[20]，其作用機制可能與氧化應激及炎癥反應有關[21-22]。因此，有必要進行右美托咪定干預幼齡動物早期麻醉藥物暴露導致的神經元損傷的影響進行進一步研究。基于此，本試驗選取7日齡發育期大鼠作為研究模型，通過連續注射氯胺酮建立發育期大鼠神經損傷模型，探究右美托咪定對氯胺酮麻醉致發育期大鼠大腦神經元損傷、氧化應激及炎癥因子釋放的影響及可能的機制。結果表明，氯胺酮麻醉會造成發育期大腦神經元損失、氧化應激及炎癥因子的釋放，而右美托咪定能夠有效減輕氯胺酮對發育期大腦的神經毒性。

圖4 大鼠海馬中炎癥因子IL-1β和IL-18的變化Fig.4 Changes of IL-1β and IL-18 in rat hippocampus

圖5 大鼠大腦皮質中炎癥因子IL-1β和IL-18的變化Fig.5 Changes of IL-1β and IL-18 in cerebral cortex of rat

哺乳動物的大腦在發育期以不同形式的突觸構建成復雜的神經網絡，該階段的神經元比較敏感，很容易受到外界刺激的影響[23]。在這一時期使用氯胺酮能夠改變神經細胞生理平衡并對大腦正常發育產生不利影響。1999年，Ikonomidou等[15]關于全身麻醉藥物對于神經細胞凋亡的研究顯示：在對出生后第0、3和7日齡的大鼠中應用NMDA受體拮抗劑可導致大腦神經細胞死亡，隨后的研究顯示，多次注射20 mg·kg-1氯胺酮會引起7日齡大鼠額葉皮質神經元凋亡顯著增加，使NMDAR1亞基的蛋白和基因表達上調，而非麻醉劑量的氯胺酮則不會造成這種損傷[24-25]。本研究結果顯示，連續氯胺酮給藥后7日齡大鼠大腦神經元損傷，具體表現為海馬CA1及CA3區和皮質的神經元丟失增加、尼氏體數量減少、密度降低且排列混亂；右美托咪定提前30 min給藥能夠有效降低氯胺酮引起發育期大鼠大腦神經元丟失。此外，單獨給予右美托咪定并沒有引起海馬和皮質神經元死亡，這與筆者的預期一致。

通常情況下，生物體內的抗氧化與氧化系統保持著動態平衡。細胞內抗氧化與氧化系統之間的不平衡就會引起氧化應激[26]。體內還同時存在很多過氧化物和抗氧化物。如MDA、GSH和CAT等。MDA是脂質過氧化反應后終產物，會導致蛋白質和DNA等發生交聯反應導致細胞死亡，還會影響線粒體膜和細胞膜的破壞。CAT存在于各種細胞中，作為一種自由基清除劑，可以清除體內過量的過氧化氫，以保護細胞免受氧化損傷。GSH能夠保護機體免受ROS損傷，維持機體的正常抗氧化功能[27-28]。Li等[29]和潘寅兵等[30]研究發現，孕期大鼠應用氯胺酮后其子代大鼠大腦ROS水平和過氧化物含量增加，最終引起氧化應激，造成神經損傷。在本研究中發現對發育期連續注射氯胺酮，其皮質和海馬中抗氧化物質GSH和CAT的含量顯著下降，而脂質過氧化物MDA含量顯著升高，這些結果說明了氯胺酮造成了氧化應激損傷。而使用右美托咪定預先給藥再注射氯胺酮后的發育期大鼠的抗氧化水平增加、脂質過氧化水平降低：CAT和GSH顯著升高，MDA下降，這些結果進一步表明，右美托咪定可以降低氯胺酮導致的氧化應激水平增加。

IL-1β和IL-18是非常重要的促炎性細胞因子，具有自分泌、旁分泌和全身性功能[31]。炎性因子IL-1β和IL-18的濃度增加也在氯胺酮導致發育期大鼠大腦神經損傷中發揮了重要作用。因此在本研究中也檢測了海馬和皮質組織中IL-1β 和IL-18的含量。結果表明，氯胺酮顯著增加了大鼠皮質和海馬中炎癥因子IL-1β和IL-18的水平，這可以從側面說明氯胺酮加重了發育期大鼠的炎癥反應。而通過右美托咪定預先給藥改變了氯胺酮導致的炎癥反應。

4 結 論

右美托咪定預處理能夠有效降低發育其大鼠海馬和皮質MDA水平、增加CAT和GSH含量，并抑制炎癥因子IL-1β和IL-18的分泌，在氯胺酮致發育期大鼠神經損傷時發揮神經保護作用。