化妝品原料五色梅全草提取液的功效評價

鄧金生 鄧明玉 方岱溶 何秋星

五色梅全草提取液活性物以黃酮為主，在化妝品中具有許多優良的性能。通過DPPH·抗氧化試驗、MIC與抑菌圈抑菌試驗及雞胚尿囊膜血管試驗（HEA CAM）等探究其功效性。研究結果表明五色梅全草提取液的IC50 為0.3842mg/ mL;對大腸艾希氏菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的最小抑菌濃度分別為125mg/mL、62.5mg/mL 和125mg/mL，其抑菌圈大小分別為10.58mm、 10.20mm 和9.80mm。HEA-CAM試驗中1mg/mL的五色梅提取液的刺激性評分IS為4.98，表明該提取液具有輕度眼刺激性。本試驗為五色梅全草提取液在化妝品中的應用提供依據。

五色梅（ Lantana camara L.）又名臭草、馬纓丹，是馬鞭草科馬纓丹屬植物。五色梅分布廣泛，主要產于江西、浙江、湖南、廣西、廣東等地，以野生為主。研究資料顯示[1]，五色梅植株中主要的非揮發性化學成分是萜類，此外，還包括黃酮、呋喃萘醌、苯乙醇苷和酚酸類化合物等。

鄭達敏[2]等對五色梅進行系統的生藥學研究，包括五色梅的顯微結構、理化性質、性狀等方面，為五色梅用藥方面提供一定依據。韋賢[3]等發現五色梅總黃酮可能通過改善炎性組織液中TNF-a、IL-1β 及抗氧化水平機制，而對Ⅱ型膠原導致的大鼠關節炎癥狀進行有效改善。盧衛紅[4]等分離得到五色梅葉片中的屬青霉屬（Penicilliumsp）的內生真菌，并且發現這種真菌的菌絲體發酵培養液能夠抑制金黃色葡萄球菌。張偉[5]等對五色梅不同部位的總黃酮含量進行探究，發現五色梅的不同部位的總黃酮含量不同，且五色梅的乙醇提取液具有一定的抗氧化活性。由于五色梅具有多種生物活性，生長力旺盛，容易存活，廉價易得，具有良好的開發應用前景。

1. 實驗部分

1.1原材料與儀器

實驗所使用的五色梅購買于湖南省神農本草藥業有限公司，實驗所使用儀器見表1。

1.2. 五色梅全草提取液的功效評價

1.2.1 五色梅全草提取液的提取工藝

（1）五色梅的預處理：將干的五色梅全草在60℃的恒溫干燥箱中干燥至恒重，經研磨粉碎后得到五色梅粉末，將粉末于室溫下密封保存。

（2）提取：稱取1g 五色梅粉末，加入乙醇，用玻璃棒攪拌均勻，超聲提取一段時間，趁熱抽濾，定容至100 mL，備用。

1.2.2 DPPH 自由基清除試驗

稱取0.0039gDPPH，加65% 的乙醇溶解，定容備用;按照表2準確吸取Ac、Ai、Aj三組反應液于4mLEP管中。

混勻后，避光20min 進行反應，在波長517nm 處測吸光度，按式-1計算清除率S。

清除率（%）= （1-（Ai-Aj）/Ac）*100%（式-1）

以提取液濃度為橫坐標，清除率為縱坐標作圖。線性擬合，根據擬合結果計算IC50

1.2.3 五色梅提取液的抑菌性能測試

①培菌與菌懸液制備

將銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌的菌種接種于普通瓊脂斜面培養基，痤瘡丙酸桿菌接種于腦一心浸液斜面培養基（BHI），用滅菌液體石蠟液封以達無氧環境，置于37℃C恒溫培養箱中培養2～ 3天。

培菌完成后，用生理鹽水 3mL 分別洗出斜面上的菌苔，充分搖勻，制成一定濃度的細菌懸液，置于4℃冷藏貯放備用。

②最低抑菌濃度（MIC）的測定

取1mL 濃縮到1g/mL 五色梅提取液（生藥量），加入到1mL 的液體培養基中，混合均勻，再從中吸取1mL稀釋的提取液，加入到1mL的液體培養基中，以此類推，得到一系列不同濃度的五色梅提取液。

取0.1mL 含菌量約為108CFU/mL 大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌的菌懸液接種于含抑（抗）菌劑的液體培養基的試管中，制備試驗組樣本，并設陰性對照管（卡松、培養基）、陽性對照管和純培養基對照管（菌懸液、培養基）。

當陽性對照管有細菌混濁，陰性對照管無菌透明，試驗組無菌生長的最高稀釋度為該樣品對受試菌的 MIC。

③抑菌圈實驗法

目前，抑菌圈試驗的方法主要有：杯碟法、Kirby- Bauer 法（以下簡稱K-B紙片擴散法）、平板打孔法等。 K-B 紙片擴散法可用于生長快速的細菌。因此，[前后沒有必然因果聯系，聯系作者修改]綠膿桿菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈試驗采用 K-B 紙片法。其操作方法如下：

傾注20mL 左右平板培養基于已滅菌的平板中，水平靜置，等待凝固。在制備好的平板上接種0.1mL 菌懸液，涂布均勻后，將浸泡在lg（生藥量）/mL 五色梅提取液的滅菌濾紙片取出，放到培養基中，輕輕按壓，每個培養皿均勻放置3 張紙片，并且在同一個平皿中，放置1片浸泡65% 乙醇的紙片，充當溶劑對照。以浸泡生理鹽水的紙片設置空白對照組，設置陽性對照是放置浸泡0.5%的卡松溶液的紙片。在37℃下，將培養基培養 18h，測定抑菌圈直徑，其結果見表3。

1.2.4 雞胚絨毛尿囊膜血管試驗（HET-CAM）

參照《化妝品眼刺激性/腐蝕性的雞胚絨毛尿囊膜試驗》（SN/T2329-2009） 進行，試驗采用反應時間法。根據結果按式-1 計算刺激評分（IS）。

式2-6中：sec H為CAM首次出血的平均時間，單位是s（下同）;sec L為CAM出現血管融解的平均時間;sec C（凝血時間）是開始觀察到CAM 出現凝血的平均時間。

2.結果與討論

2.1 DPPH 自由基清除實驗結果

五色梅總黃酮提取液的濃度對DPPH 自由基的清除率影響，結果見圖1。

由圖1可知，濃度在0.10mg/MI～0.60mg/mL 時，五色梅提取液對DPPH 的清除率隨著五色梅濃度的增大而上升，且呈線性關系。其線性擬合方程為：y=1.5844x-0.1088，R2=0.99.38，由此可計算出五色梅的IC50為0.3842mg/mL。

2.2 抑菌實驗結果

由表4可知，大腸艾希氏菌與表皮葡萄球菌的 MIC為125mg/mL，金黃色葡萄球菌的MIC為62.5mg/mL。說明相比于大腸桿菌和表皮葡萄球菌，五色梅提取液對金黃色葡萄球菌的抑制效果更強。1g/mL五色梅提取液（生藥量）對大腸艾希氏菌、金黃色葡萄球菌及表皮葡萄球菌有一定的抑制作用。

2.3 刺激性實驗結果

用濃度為1mg/mL、10mg/mL 的五色梅提取液采用反應時間法進行試驗。如圖2和表5所示，1mg/mL 五色梅提取液IS值為4.98，在1到5 之間，存在輕度的眼刺激性。10mg/mL 五色梅提取液IS 值為8.35，在5 到9 之間，存在中度的眼刺激性。

3.結論

本文通過DPPH自由基清除試驗、MIC 試驗、抑菌圈試驗及雞胚絨毛尿囊膜試驗對五色梅全草提取液的功效進行了探究。

五色梅提取液的體外抗氧化性能測試表明其對DPPH自由基IC50 為0.38mg/mL;對大腸艾希氏菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌均具有抑制作用，其中，大腸艾希氏菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的MIC 分別為125mg/mL、62.5mg/mL及125mg/mL，其抑菌圈大小分別為10.58mm、10.20mm、9.80mm。HEA-CAM試驗中1mg/mL 的五色梅提取液的刺激性評分IS 為4.98，表明該提取液有弱眼刺激性。

作者鄧金生和鄧明玉供職于廣州今盛美精細化工有限公司;方岱溶和何秋星供職于廣東藥科大學。

本項目受 2020年度省級大學生創新創業訓練計劃項目資助（項目編號： S202010573045）

參考文獻

[1]余細紅，向亞林.馬纓丹的綜合利用研究[J]. 亞熱帶植物科學，2012， 41（4）：83-87.

[2]鄭達敏，周寧.中藥五色梅的生藥學研究[J].亞太傳統醫藥，2012.8（04）：16-17[3]韋賢，王金妮，李振中，等.五色梅總黃酮治療Ⅱ型膠原誘導大鼠關節炎及其機制[J]. 醫藥導報，2015，34（02）：189-192.

[4] 盧衛紅，洗瓊珍，朱峰.五色梅葉內生真菌YJ-11的分離鑒定及其抑菌活性[J].湖北農業科學，20l3，52（24）：6048-6050.

[5] 張偉，吳靜姝，宋照風，等.五色梅總黃酮含量測定與自由基清除活性分析[J.湖北農業科學，2014，53（21）：5227-5230.