黃瓜果頂形狀遺傳與QTL定位

李毅 宋曉飛 李曉麗 孫成振 張美迪 閆立英

摘? ? 要：對黃瓜果頂形狀進行QTL分析和候選基因預測，可為黃瓜新品種選育提供理論基礎。以果頂平頭形自交系玉女和果頂瘦尖形自交系R7構建的F2代分離群體為材料，對黃瓜果頂形狀遺傳及其QTL進行分析。結果表明，黃瓜果頂瘦尖形為不完全顯性遺傳的數量性狀。基于QTL-Seq發現6個與黃瓜果頂形狀有關的QTL，分別位于1號、2號、3號、4號、5號和6號染色體上，共包含108個SNP和InDel位點，含有12個變異基因。其中只有6號染色體上的CsaV3_6G005930.1基因在外顯子上發生SNP替換（C-A）形成終止密碼子，導致翻譯提前終止，預測 CsaV3_6G005930.1是與果頂形狀相關的候選基因，該基因編碼一個未知蛋白。

關鍵詞：黃瓜;果頂形狀;QTL定位

中圖分類號：S642.2 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）07-007-07

Inheritance and QTL mapping of fruit apex shape in cucumber

LI Yi， SONG Xiaofei， LI Xiaoli， SUN Chengzhen， ZHANG Meidi， YAN Liying

（College of Horticulture Science and Technology， Hebei Normal University of Science and Technology， Qinhuangdao 066600， Hebei， China）

Abstract： QTL analysis and candidate genes prediction of the fruit apex shape can provide a theoretical foundation for the breeding of new cucumber varieties.In this study， the genetic and QTL of fruit apex shape were analyzed by using F2 population which was constructed with an inbred line of flat fruit apex Yunü （P1） and an inbred line of sharp fruit apex R7 （P2） as parents.Genetic analysis showed that the fruit sharp apex of cucumber was a quantitative character with incomplete dominant inheritance. Six QTLs related to fruitapex shape of cucumber were located on chromosome 1， chromosome 2， chromosome 3， chromosome 4， chromosome 5 and chromosome 6 by QTL-Seq， respectively. A total of 108 SNP and InDel locus which related to the fruit apex shape were located，contained 12 mutation genes.Only the CsaV3_6G005930.1 gene on chromosome 6 happened a SNP replacement （C-A） to form the termination codon， and resulted in premature termination of translation. Therefore， CsaV3_6G005930.1 is a strong candidate gene for fruit apex shape， which encodes an unknown protein.

Key words： Cucumber; Fruit apex shape; QTL mapping

黃瓜是全球重要的經濟作物，其果實大小和形狀具有豐富的多樣性[1]。不同黃瓜品種之間果實形狀差異很大，如長棒形、短棒形、卵圓形、球形和指形黃瓜等。果實形狀直接影響黃瓜的外觀品質和商品價值，因此，培育符合消費者需求的果形品種已成為黃瓜新品種選育的重要方向之一[2]。果頂是黃瓜果實的重要組成部分，果頂形狀的改變直接影響果實的形狀。因此，定位果頂形狀相關QTL可為黃瓜果形遺傳改良提供理論依據。

辣椒、茄子和番茄作物的果頂形狀均為數量性狀且由多個QTL調控。Chaim等[3]通過QTL分析鑒定到55個與辣椒形狀相關的QTL，其中有3個QTL與辣椒果頂形狀有關。張佳琦[4]利用小椒和大椒雜交構建F2分離群體，利用SPAR和SSR分子標記對其進行QTL分析，定位到6個與辣椒果頂形狀相關的QTL。耿樹文[5]以圓頂茄子自交系283為母本、尖頂茄子自交系284為父本進行雜交，構建6世代遺傳群體，通過QTL定位鑒定到3個與茄子果頂形狀相關的QTL（fe5.1、fe10.1、fe10.2），fe5.1位于茄子5 號連鎖群Marker1322249 和 Marker2732214之間、fe10.1位于10號連鎖群Marker897334 和 Marker894480之間、fe10.2位于10號連鎖群Marker4365090 和 Marker2070220 之間。Brewer等[6]對番茄進行形態學鑒定時，發現4個與番茄果頂形狀相關的QTL （dan7.1，dan7.2，dan8.1，dan12.1）。前人在對黃瓜果實性狀研究時主要集中于果實形狀，對果頂形狀研究相對較少。高智慧[7]以長棒形黃瓜自交系CNS21和近圓形黃瓜自交系RNS7為親本，對調控果形相關的QTL進行定位，共定位到58個與果實大小和形狀相關的QTL;同時，結合QTL定位和基因組重測序，預測了5個可能與黃瓜果形相關的候選基因。簡興等[8]以長棒形黃瓜二早子和短棒形黃瓜NC-76為親本，應用主基因+多基因混合遺傳模型分析了黃瓜果形的遺傳特性，結果表明果形是多基因控制的數量性狀，果形指數的遺傳符合加性-顯性-上位性多基因（C-0）模型，并且果形遺傳受環境影響較大。潘玉朋[9]以特異性地方自交系WI7239和半野生的版納黃瓜自交系WI7167為材料，通過QTL定位等方法揭示了黃瓜圓形果形態建成的遺傳調控機制，結果表明，果實大小/形狀的遺傳變異由2個互作QTL位點FS1.2和FS2.1調控。苗晗等[10]以華北保護地黃瓜9930和歐洲溫室黃瓜9110Gt為親本構建遺傳圖譜，結合不同年份、不同季節表型鑒定數據，對12個黃瓜果實相關性狀進行QTL模型（MQM）分析，共檢測到32個與黃瓜果實性狀相關的QTL。朱拼玉等[11]將黃瓜果頂形狀分為鈍圓形、卵圓形和瘦尖形，鈍圓形果形指數為1.4～2.2，卵圓形果形指數為1.8～2.5，瘦尖形果形指數為2.4～3.4，對不同黃瓜果頂形狀進行遺傳規律分析和QTL定位，結果表明鈍圓形和卵圓形果頂遺傳均為不完全隱形遺傳，符合A-0模型，受一對主基因控制，bft6.1是控制鈍圓形果頂的主效QTL位點，oft4.1是控制卵圓形果頂的主效QTL位點。目前對黃瓜果頂形狀的遺傳基礎研究較少，調控果頂形狀的基因尚不明確。

筆者在本研究中以果頂平頭形黃瓜自交系玉女為母本（P1），以果頂瘦尖形黃瓜自交系R7為父本（P2），構建F1代和F2代分離群體，采用QTL-Seq方法定位與果頂形狀相關的基因，為克隆黃瓜果頂形狀相關基因和優良品種選育奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

以來自山東壽光蔬菜種業集團有限公司自主研發的歐洲溫室型品種玉女和河北科技師范學院引進并純化的日本類型優良自交系R7為試驗材料。其中玉女果頂為平頭形，R7果頂為瘦尖形，雜交獲得F1和F1反，F1自交獲得F2代分離群體種子。2018年8月播種各世代種子，采用穴盤育苗，2葉1心時定植，雙高壟地膜覆蓋栽培，大行距80 cm，小行距50 cm，株距25 cm，P1、P2分別定植25株，F1定植12株，F1反定植17株，F2定植125株，所有材料均定植于河北科技師范學院施各莊基地塑料大棚，田間常規管理。

1.2 黃瓜果頂形狀調查與統計

2018年9月，在結果盛期對各世代的正常商品瓜進行表型鑒定，每株選取10個正常商品瓜，根據《黃瓜種質資源描述規范和數據標準》[12]對選取的黃瓜商品瓜的果頂形狀進行觀察、定性及劃分鑒定，用Excel 2016對結果進行統計。

1.3 方法

采用QTL-Seq技術[13]對黃瓜果頂形狀進行QTL定位。在F2代分離群體中選擇果頂平頭形和瘦尖形性狀的植株各20株，采用CTAB[14]法提取健康幼嫩生長點處葉片的DNA，瓊脂糖凝膠電泳分析DNA的純度和完整性，Nanodrop檢測DNA的純度（OD260/OD 280比值），Qubit對DNA濃度進行精確定量。相同表型植株的DNA質量檢測合格后進行等濃度混合，構建果頂平頭形混池（gdp）和果頂瘦尖形混池（gdj）。將父、母本分別構建父本池（P2）和母本池（P1）。由天津諾禾致源有限公司采用QTL-Seq方法進行QTL定位。通過illuminaHiSeqTMPE150測序平臺對F2代2個極端表型混池和2個親本池進行測序，獲得原始數據。對原始數據進行過濾獲得高質量的clean reads。通過BWA[15]軟件中mem算法將clean reads與黃瓜參考基因組（Cucumber （Chinese Long） v3）比對，比對結果經SAMTOOLS去除重復。通過ANNOVER[16]軟件對候選區間SNP和InDel進行功能注釋。參考黃瓜基因組數據庫（http：//cucurbitgenomics.org/）和擬南芥基因組數據庫（https：//www.arabidopsis.org/）對候選區間內的基因進行功能分析，預測候選基因。

2 結果與分析

2.1 黃瓜果頂形狀的遺傳分析

對2018年秋季的親本、F1、F1反和F2代分離群體的果頂形狀進行鑒定。結果表明，以果頂平頭形黃瓜自交系玉女（P1）與果頂瘦尖形黃瓜自交系R7（P2）雜交所得的F1，無論正交還是反交，后代均表現為中間性狀鈍圓形，F2代分離群體則表現為平頭、鈍圓與瘦尖3種表型，比例為25.6%∶43.2%∶31.2%，接近1∶2∶1，且表型易受到環境影響。遺傳分析結果表明，黃瓜果頂瘦尖形為不完全顯性遺傳的數量性狀（表1）。

2.2 測序數據質量分析

對親本及2個果頂極端表型混池進行高通量測序并獲得29.949 G原始數據，原始數據中含有接頭或低質量的reads。為了保證后續信息分析的準確性，需要對原始數據進行過濾，過濾標準如下：1）過濾點帶接頭的reads;2）過濾掉單端測序reads中N的含量超過reads長度10%的reads;3）過濾掉單端測序reads中低質量堿基超過reads長度比例50%的reads。最終得到29.633 G clean reads。對測序結果進行質量分布檢查，測序錯誤率用e表示，Illumina HiSeqTM/MiseqTM的堿基質量值用Qphred表示，Qphred=-10log10（e）。利用測序結果的Qphred數值，進行堿基錯誤率計算，結果為Q20≥94.74%、Q30≥88.21%，測序質量高，GC含量38.46%～39.28%（表2）。

所有樣本的reads與黃瓜參考基因組的比對數在94.33%～96.25%之間，平均測序深度在20.47X～26.22X，1X的覆蓋比率在98.31%以上，4X的覆蓋比率在95.93%以上（表3）。比對結果良好，可以用于后續的變異分析。

2.3 黃瓜果頂形狀QTL定位

基于基因分型的結果，篩選兩個親本間純合差異的標記，共篩選出286 947個多態性標記。以親本P1作為參考親本，分析計算2個子代的SNP-index與InDel-index（即SNP與InDel-index的頻率），以1 Mb為窗口，1 kb為步長，對gdj和gdp中SNP（圖1-A、B）和InDel（圖2-A、B）在染色體上的分布作圖。

統計2個極端性狀混池的SNP-index和InDel-index，并計算子代池ΔSNP-index，在95%置信水平下，以ΔSNP-index值大于閾值的窗口作為候選區域，共檢測到30個與果頂形狀有關的SNP位點，分別位于1號染色體（8.225～31.309 Mb）、3號染色體（21 668 266 bp）、4號染色體（15.700～18.230 Mb）和6號染色體（5 047 789 bp）上（圖1-C）。

同樣在95%置信水平下，以ΔInDel-index值大于閾值的窗口作為候選區域，共檢測到78個與果頂形狀有關的InDel位點，分別位于1號染色體（7.755 ～32.155 Mb）、2號染色體（6.113～9.008 Mb）、4號染色體（14.703～23.033 Mb）、5號染色體（25.035Mb）和6號染色體（17.881～24.954 Mb）上（圖2-C）。

將SNP-index和InDel-index合并后得到直觀的Allindex在染色體上的分布情況，以95%為閾值計算ΔAll-index，最終定位到6個與黃瓜果頂形狀相關的QTL，含有108個SNP和InDel位點，分別位于1號染色體（7.755～32.155 Mb）、2號染色體（6.113～9.008 Mb）、3號染色體（21 668 266 bp）、4號染色體（14.703～23.033 Mb）、5號染色體（25 035 518 bp）和6號染色體（5.047～24.954 Mb）上（圖3）。

在全基因組范圍內篩選2個子代SNP-index和InDel-index差異顯著的位點，即在果頂平頭形混池中SNP-index和InDel-index接近0.9，且在果頂瘦尖形混池中SNP-index和InDel-index接近0.15的位點。變異位點統計見表4。

2.4 候選基因分析與預測

基于QTL-Seq結果，在候選區域內獲得候選變異位點108個。挑選其中All-index接近0或者1的位點作為SNP或InDel的候選位點，候選區間內一共含有12個變異基因。優先挑選引起stoploss、stopgain、非同義突變或可變剪接的位點所在的基因作為候選基因。變異類型篩選結果表明，只有6號染色體上CsaV3_6G005930.1在外顯子上發生SNP替換（C-A）形成終止密碼子，導致翻譯提前終止（表5）。因此，預測CsaV3_6G005930.1為黃瓜果頂形狀的候選基因，該基因編碼一個未知蛋白。

3 討論和結論

果實形狀是影響黃瓜外觀品質和商品價值的重要指標[17-18]。果頂是黃瓜果實外形的重要組成部分，具有豐富的多樣性。朱拼玉等[11]對黃瓜重組自交系中145株鈍圓形-瘦尖形分離群體和155株卵圓形-瘦尖形分離群體中果頂形狀進行遺傳規律分析和植株數量性狀主基因+多基因混合模型分析，結果表明果頂鈍圓形和果頂卵圓形黃瓜遺傳均表現為不完全隱性遺傳，符合A-0模型，主要受1對主基因控制。筆者通過果頂平頭形自交系玉女和果頂瘦尖形自交系R7雜交構建F1、F1反和F2代群體并進行遺傳分析，發現F1和F1反的果頂均為鈍圓形，F2果頂表現為平頭、鈍圓與瘦尖3種表型，且后代分離比接近1∶2∶1，由此認為黃瓜果頂瘦尖形為不完全顯性遺傳的數量性狀，與前人研究結果一致。

朱拼玉等[11]對黃瓜果頂形狀相關基因進行定位，發現鈍圓形果頂受到bft4.1和bft6.1控制，其中bft6.1（87.99 ～113.09 cM）是控制果頂形狀的主效位點。卵圓形果頂受oft3.1、oft3.2、oft3.3、oft4.1、oft4.2、oft5.1控制，且oft4.1（50.62 ～62.40 cM）是控制卵圓形果頂的主效位點。在本研究中利用F2代分離群體，通過QTL-Seq對樣本池和雙親池進行高通量測序，尋找差異的SNP和InDel，進而預測黃瓜果頂形狀相關的候選基因。基于QTL-Seq結果定位到108個與果頂形狀相關的SNP和InDel位點，分別位于1號染色體、2號染色體、3號染色體、4號染色體、5號染色體和6號染色體上，共包含12個發生變異的基因。其中，只有6號染色體上CsaV3_6G005930.1（5 047 789 bp）在外顯子上發生SNP替換（G-A）形成終止密碼子，導致翻譯提前終止。因此，預測CsaV3_6G005930.1為黃瓜果頂形狀相關的候選基因。與前人研究結果相比較，本研究結果預測的候選基因CsaV3_6G005930.1位于6號染色體5 047 789 bp處，與前人預測的6號染色體的候選區間不重合。因此，筆者預測到一個新的與黃瓜果頂形狀相關的候選基因，且該基因功能未知（unknown protein）。筆者將進一步對候選基因進行序列變異分析和生物信息學分析，驗證候選基因的準確性，為后續克隆該基因奠定理論基礎。

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