青光安Ⅱ號方對誘導損傷的RGC-5細胞中NF-κB/HIF-1α通路相關細胞因子的影響

姚小磊 時健 劉倩宏 陳立浩 侯念婷

〔摘要〕 目的 觀察青光安Ⅱ號方對谷氨酸誘導損傷的RGC-5細胞中核因子κB（nuclear factor kappa-B， NF-κB）、低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）、BCL2/腺病毒E1B相互作用蛋白3（BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3， BNIP3）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）及丙二醛（malondialdehyde， MDA）的影響。方法 體外培養RGC-5細胞，分為4組：空白組、模型組、含藥血清組和阻斷劑組。模型組、含藥血清組和阻斷劑組予以谷氨酸誘導細胞損傷，模擬青光眼對神經節細胞的損傷，含藥血清組加入青光安Ⅱ號方含藥血清，阻斷劑組加入KC7F2進行HIF-1α通路的阻斷。以CCK-8法摸索含藥血漿以及谷氨酸的最佳干預濃度;采用Hoechst法檢測各組細胞的凋亡情況;Western blot檢測NF-κB、HIF-1α、BNIP3蛋白表達情況;比色法檢測SOD、MDA的表達情況。結果 CCK8法確定青光安Ⅱ號方5倍組含藥血清為實驗量，確定谷氨酸的最佳干預濃度為200 μM。與空白組比較，模型組NF-κB、HIF-1α、BNIP3、SOD、MDA表達顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，含藥血清組、阻斷劑組NF-κB、HIF-1α、BNIP3和SOD的表達顯著降低（P<0.05）;含藥血清組與阻斷劑組的NF-κB、HIF-1α、BNIP3、SOD及MDA差異均無統計學意義（P>0.05）。結論 青光安Ⅱ號方對NF-κB具有抑制作用，進而抑制了HIF-1α相關通路的激活，減弱了由于氧化應激所致RGC-5細胞的凋亡，對RGC具有保護作用。

〔關鍵詞〕 青光眼;青光安Ⅱ號方;視網膜神經節細胞;核因子κB;低氧誘導因子-1α;BCL2/腺病毒E1B相互作用蛋白3;超氧化物歧化酶;丙二醛

〔中圖分類號〕R276.7 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.07.004

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Qingguangan Ⅱ Formula on nuclear factor kappa-B （NF-κB）， hypoxia inducible factor-1 （HIF-1α）， BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3 （BNIP3）， superoxide dismutase （SOD） and malondialdehyde （MDA） in RGC-5 cells injury induced by glutamate. Methods The RGC-5 cells cultured in vitro were divided into 4 groups： blank group， model group， drug-containing serum group and blocker group. Glutamic acid was added to model group， drug-containing serum group and blocker group to simulate retinal ganglion cell damage caused by glaucoma， and Qingguangan Ⅱ Formula serum was added to drug-containing serum group， and the blocker group was added with KC7F2 to block the HIF-1α pathway. The CCK-8 method was used to find optimal intervention concentration of drug-containing plasma and glutamate; Hoechst method was used to detect the apoptosis of cells in each group; Western blot was used to detect the expression of NF-κB， HIF-1α， BNIP3; colorimetry was used to detect the expression of SOD and MDA. Results CCK8 method determined 5 times serum content as the Qingguangan Ⅱ Formula experimental amount， and the optimal intervention concentration of glutamate was 200 μM. Compared with blank group， the expression of NF-κB， HIF-1α， BNIP3， SOD and MDA increased significantly in the model group （P<0.05）; compared with the model group， the expression of NF-κB， HIF-1α， BNIP3 and SOD in the drug-containing serum group and blocker group significantly decreased （P<0.05） ; there was no statistically significant difference between NF-κB， HIF-1α， BNIP3， SOD and MDA in drug-containing serum group and blocker group （P>0.05）. Conclusion Qingguangan II Formula has an inhibitory effect on NF-κB， thereby inhibiting the activation of HIF-1α related pathways， reducing the apoptosis of RGC-5 cells caused by oxidative stress， it also has a protective effect on RGC.

〔Keywords〕 Qingguangan Ⅱ Formula; retinal ganglion cell; nuclear factor kappa-B; hypoxia inducible factor-1; BCL2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3; superoxide dismutase; malondialdehyde

青光眼為導致人類失明的三大眼類疾病之一。調查顯示，2020年全球青光眼患病人數高達7 600萬，其中我國占2 100萬，位居世界之首[1]，目前，超過40歲以上人群青光眼的總患病康復率僅有1.5%～3.6%[2]，治療方案主要以控制眼壓來保存視力，但是青光眼導致的視神經損傷卻不可逆，且沒有較好的視神經保護方案。彭清華教授通過多年臨床經驗總結出“青光安Ⅱ號方”，研究表明其有較好的臨床療效，尤其對青光眼術后仍存在視力下降的患者，有較好的視神經保護效應[3]，但其具體的機制并不清楚。動物實驗中發現青光安Ⅱ號方對于Caspase-3有影響，可減少視網膜神經細胞的凋亡[4]。有研究表明，青光眼的視神經損傷可能與氧化應激有關[5-6]，活性氧的增加是小膠質細胞在高眼壓過程中死亡的主要原因[7]。因此，本研究通過實驗的方法探討青光安Ⅱ號方對RGC-5細胞模型[8]中核因子κB（nuclear factor kappa-B， NF-κB）/低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1， HIF-1α）通路中相關因子的影響，以期明確其視神經保護的相關機制。

1 材料與方法

1.1 ?動物及細胞

取健康SPF級雄性和雌性SD大鼠各30只，由湖南省斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2019-2004，體質量0.17～0.28 kg。動物實驗倫理合格證號：LL2019121901。RGC-5細胞株（批號：CP-M122，武漢普諾賽生命科技有限公司）。

1.2 ?藥物

中藥配方：黃芪（批號：CK19111807）、枸杞子（批號：SL19112203）、燈盞細辛（批號：2019011616）、牛膝（批號：CK19101401）、川芎（批號：SL19111503）、女貞子（批號：2019011201）均購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院。

1.3 ?試劑與儀器

CCK-8試劑盒（批號：CA1210）、30%制膠液（批號：A1010）均購自索萊寶公司;總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）測定試劑盒（批號：A001-3-2）、丙二醛（malondialdehyde， MDA）測定試劑盒（批號：A003-1）均購自南京建成公司;Tris（中國醫藥集團有限公司，批號：30188216）;5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（批號：P0015L）、ECL發光液（批號：P0018S-2）均購自上海碧云天生物技術有限公司;蛋白Marker（賽默飛世爾科技公司，批號：26617）;PVDF膜（美國密理博公司，批號：IPVH00010）;膜再生液（北京普利萊基因技術有限公司，批號：P1650）;HIF-1α（批號：ab1）、BCL2/腺病毒E1B相互作用蛋白3（BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3，BNIP3）（批號：ab109362）、NF-κB（批號：ab16502）均購自上海Abcam生物技術有限公司;GAPDH（美國proteintech公司，批號：10494-1-AP）;羊抗兔-HRP（北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs-0295G-HRP）;KC7F2（上海浩洋生物科技有限公司，批號：S7946）。

酶標儀（上海碧云天生物技術有限公司，型號：Synergy H4）;KHB洗板機（上海科華實驗系統有限公司，型號：ST-36WT）;電泳儀（伯樂生命醫學產品有限公司，型號：1645070）;電轉儀（伯樂生命醫學產品有限公司，型號：BE6085）;全自動化學發光圖像分析系統（上海天能科技有限公司，型號：5200）。

1.4 ?含藥血清的獲取

將60只SD大鼠隨機分成青光安Ⅱ號方10倍組、青光安Ⅱ號方5倍組、青光安Ⅱ號方2.5倍組和空白組。按體表面積換算的方法計算出每只大鼠的灌藥量，灌藥大鼠均按照10倍成人等效劑量灌胃。適應性飼養1 d后開始灌胃，空白對照組灌同等劑量的生理鹽水，每日1次。灌胃7 d后，提取血清。取血方法：每只大鼠麻醉前1 h灌胃，大鼠麻醉、固定，頸總動脈采血，離心提取含藥血清和空白血清。青光安Ⅱ號方10倍組：所取血清即為高劑量血清;青光安Ⅱ號方5倍組：所取血清加入1倍體積DMEM低糖培養基，設為中劑量血清;青光安Ⅱ號方2.5倍組：所取血清加入3倍體積DMEM低糖培養基，設為低劑量血清。收集的血清56 ℃下滅活補體30 min，按組別混合后放-80 ℃冰箱保存。

1.5 ?含藥血清加入量及谷氨酸加入量的摸索

采用CCK-8法確定含藥血清及谷氨酸加入量。將細胞以2×104個/mL、200 μL/孔的密度接種在96孔板中，在37 ℃、5% CO2箱中培養24 h，移出孔板，分別加入0、25、100、200 μM的谷氨酸;繼續放回37 ℃、5% CO2箱進行培養;24 h干預后取出96孔板;向每個孔中添加10 μL CCK-8反應溶液;在37 ℃、5% CO2箱中繼續孵育2 h;用酶標儀測量450 nm處的吸光度（OD），并通過存活率判定各種濃度下的細胞增殖活性，由此選擇適當的谷氨酸濃度。同時按照上述方法分別加入3種不同濃度的24 μL含藥血清，通過存活率OD判定各種濃度下的細胞增殖活性。選擇適當的含藥血清濃度。

1.6 ?細胞模型建立及分組、干預

使用RGC-5細胞株，培養至狀態良好，體外培養的RGC-5細胞分為4組。空白組：10%胎牛血清的DMEM低糖培養基加空白血清進行培養。模型組：細胞培養基中加入谷氨酸，以此模擬RGC-5細胞損傷[8]，10%胎牛血清的DMEM低糖培養基加空白血清進行培養。含藥血清組：細胞培養基中加入谷氨酸，以此模擬RGC-5細胞損傷[8]，10%胎牛血清的DMEM低糖培養基加含藥血清進行培養。阻斷劑組：細胞培養基中加入谷氨酸，以此模擬RGC-5細胞損傷[8]，10%胎牛血清的DMEM低糖培養基加含藥血清進行培養，合并使用阻斷劑KC7F2[9]2 μM處理。

1.7 ?Hoechst染色法檢測細胞凋亡

將細胞以2×104個/mL、2 mL/孔密度接種于6孔板爬片中，在37 ℃、5% CO2箱中培養24 h;取出孔板，按以上分組進行處理，先加入200 μM谷氨酸;繼續在37 ℃、5% CO2箱中培養24 h;取出孔板，按以上分組換入空白對照血清、5倍青光安血清、以及5倍青光安血清和KC7F2;繼續在37 ℃、5% CO2箱中培養24 h;取出孔板，吸去上清液，每孔加入1 mL Hochest染色劑，繼續在37 ℃、5% CO2箱中培養30 min;取出孔板，觀察是否出現熒光;如果出現熒光，首先吸去上清液，PBS清洗2次，封片。每組拍攝3次。

1.8 ?四氮唑藍（tetrazolium blue， NBT）核黃素比色法檢測SOD含量

樣品6倍稀釋后種于6孔板中培養至最佳狀態，加入底物、酶，測定孔、測定空白孔加樣品20 μL，對照孔、對照空白孔加超純水20 μL。對照孔、測定孔加酶工作液20 μL;對照空白孔、測定空白孔加酶稀釋液20 μL。每孔加底物應用液200 μL，混勻后37 ℃加熱20 min，450 nm處酶標儀讀數。結果計算公式：SOD抑制率=[（對照孔OD值-對照空白孔OD值）-（測定孔OD值-測定空白孔OD值）]/（對照孔OD值-對照空白孔OD值）×100%;SOD活力（U/mL）=SOD抑制率/50%×反應體系稀釋倍數×樣本測試前稀釋倍數。

1.9 ?硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）比色法檢測MDA含量

MDA試劑盒準備完畢后，配置相關試劑：（1）試劑一：37 ℃加熱溶解至透明;（2）試劑二：加170 mL超純水配制;（3）試劑三：加30 mL超純水后加熱95 ℃充分溶解，再加30 mL冰醋酸，混勻。空白管加無水乙醇20 μL，標準管加10 nmol/mL標準品20 μL，測定管加樣品20 μL。每管加試劑一20 μL，混勻。每管加試劑二3 mL，加試劑三1 mL。用針在離心管蓋上扎1個小孔，混勻后95 ℃加熱40 min，取出后流水冷卻，3 500 r/min離心10 min，離心半徑20 cm，取上清200 μL加入到酶標板中，532 nm處測各管吸光度值。結果計算公式：MDA含量（nmol/mL）=（測定管OD值-空白管OD值）/（標準管OD值-空白管OD值）×標準品濃度×稀釋倍數。

1.10 ?Western blot檢測NF-κB、HIF-1α、BNIP3蛋白的表達

RGC-5細胞長至90%鋪滿時再消化傳代。將細胞以5×104個/mL密度接種于6孔板中，2 mL/孔;按以上分組進行處理，37 ℃、5% CO2箱中繼續培養24 h;吸去上清液，PBS清洗1次;吸去PBS，每孔加入100 μL蛋白裂解液;細胞刮刀將細胞刮下后吸進1.5 mL離心管中，-80 ℃保存;從-80 ℃冰箱中取出樣本，置于冰上解凍，4 ℃下12 000 r/min離心20 min，離心半徑20 cm，取上清。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質濃度;根據濃度測定結果對蛋白濃度進行調整，保證不同組別之間蛋白濃度一致，每孔上樣量為30 μg，與適量5×loading buffer混勻，95 ℃、5 min后進行上樣，剩余樣本于

-80 ℃保存。制備電泳膠、上樣電泳、轉膜、封閉、孵一抗[用含2% BSA的TBST稀釋相應的一抗，NF-κB（1∶2 000）、HIF-1α（1∶500）、BNIP3（1∶2 000）];孵二抗[用封閉液稀釋HRP標記二抗（1∶5 000）]、顯色曝光、膜洗脫再生，再次進行封閉。內參孵育，加入二抗，曝光。曝光結果使用Image J軟件分析灰度值。

1.11 ?統計學分析

用SPSS 26.0軟件進行統計學分析，雙側檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。計量資料用“x±s”表示。先進行正態性及方差齊性檢驗，若數據呈正態分布，且方差齊，則進行單因素方差分析。若分析結果顯示，各組間存在差異，則采用Tukey法進行多組比較。若不滿足正態性要求，則采用非參數檢驗，若分布正態但方差不齊者，則采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 ?含藥血清和谷氨酸加入量的確定

含藥血清中空白組細胞存活率為100%，2.5倍組為89.05%，5倍組為88.96%，10倍組為74.93%。為確保含藥量，選用5倍組作為實驗量。細胞培養24 h后，谷氨酸加入量為0 μM時細胞存活率為100%、25 μM時為95.85%、100 μM時為84.87%、200 μM時為64.20%，最終選用200 μM的谷氨酸為加入量。

2.2 ?各組細胞凋亡情況

與空白組比較，模型組凋亡細胞個數明顯增多，差異有統計學意義（P<0.01）;與模型組比較，含藥血清組和阻斷劑組凋亡細胞個數明顯減少，差異均有統計學意義（P<0.01）;與含藥血清組比較，阻斷劑組凋亡細胞個數減少，但差異無統計學意義（P>0.05）。見表1、圖1。

2.3 ?各組NF-κB、HIF-1α、BNIP3蛋白表達情況

與空白組比較，模型組NF-κB、HIF-1α、BNIP3蛋白的表達明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，含藥血清組及阻斷劑組NF-κB、HIF-1α、BNIP3蛋白的表達明顯減少，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）;與含藥血清組比較，阻斷劑組NF-κB、HIF-1α、BNIP3蛋白的表達差異無統計學意義（P>0.05）;但與空白組比較，阻斷劑組HIF-1α蛋白的表達量明顯增加，而BNIP3蛋白的表達量明顯減少，差異有統計學意義（P<0.01）。見表2、圖2。

2.4 ?各組SOD和MDA含量表達情況

與空白組比較，模型組SOD及MDA的含量明顯增加，差異有統計學意義（P<0.01）;與模型組比較，含藥血清組SOD及MDA的含量明顯減少、阻斷劑組SOD明顯減少，差異均有統計學意義（P<0.01）;與含藥血清組比較，阻斷劑組SOD含量明顯減少，差異有統計學意義（P<0.01），MDA的含量差異無統計學意義（P>0.05）;但與空白組比較，阻斷劑組MDA的含量明顯增加，差異有統計學意義（P<0.01）。見表3。

3 討論

青光眼在控制眼壓后仍然可引起RGC的凋亡，目前對于視神經的挽救方式較少，神經生長因子的效果并不具有優勢[10-11]，而干細胞移植仍處于實驗室階段[12-13]。中醫藥因其具有龐大的藥物組分庫，具備從中進行創新藥物挖掘的潛力，越來越受到學者的重視。彭清華教授所創制的“青光安Ⅱ號方”對RGC的Caspase-3表達有抑制作用，能有效抑制RGC的凋亡[4]，但青光安Ⅱ號方抑制凋亡的具體機制并不清楚。

氧化應激可能與青光眼的視神經損傷有關[14-15]，研究[7]表明活性氧的增加是小膠質細胞在高眼壓過程中死亡的主要原因，而抑制氧化應激損傷則可以保護膠質細胞[16]。目前，關于中醫藥的研究中，細胞黃素、銀杏葉提取物對于缺氧損傷的RGC具有保護作用[17-18];枸杞子、丹參、川芎、燈盞細辛等，也具有視神經保護效應[19]。所以本研究從氧化應激的相關細胞因子進行研究，來驗證青光安Ⅱ號方對于RGC的保護作用是否是通過調控氧化應激相關因子來實現的。

研究表明，HIF-1α和NF-кB均是氧化應激相關通路中的核心因子，且兩者之間還有密切聯系：HIF-1α可誘導缺氧細胞中的NF-кB的活化[20];而NF-кB也可與HIF-1α啟動子結合，上調缺氧反應中HIF-1α的表達[21]。缺氧反應發生后，細胞內氧自由基的大量生成會引發SOD的上調，其最終產物MDA也會大量生成;同時引發BNIP-3的激活，誘導RGC發生線粒體自噬[22-23]。為了觀察青光安Ⅱ號方含藥血清是否是通過調控HIF-1α發揮作用，本實驗中加入HIF-1α的阻斷劑KC7F2，它是一種選擇性HIF-1α蛋白翻譯抑制劑，可抑制HIF-1α的蛋白合成，進一步抑制BNIP-3和SOD的激活。

中醫學認為青光眼的病理機制是氣虛血瘀，脈絡阻滯，目系失養，玄府閉塞，神水瘀積[24]，中醫治療宜采用益氣活血利水的治法，“青光安Ⅱ號方”在此思想指導下應運而生[25]。其組方由黃芪、枸杞子、燈盞細辛、牛膝、川芎、女貞子組成，重用枸杞子、女貞子、牛膝三味，歸肝腎經，為滋補肝腎之品，其中以枸杞子、女貞子補肝腎明目為君，另加黃芪補氣健脾，四藥補益正氣取其“正氣存內，邪不可干”之意，扶助正氣以驅邪外出。故本方以補為主，側重補肝腎之陰，同時在補益基礎上，用牛膝及燈盞細辛活血。黃芪利水，川芎行氣，一使氣行則血行、氣行亦水行，二使全方補而不滯。全方補通兼施，使目竅通暢、氣血調和，則諸癥俱解。

本次研究中，我們使用谷氨酸誘導RGC-5細胞損傷，模擬青光眼所造成的RGC凋亡[5，26-27]。本次研究結果中，模型組的NF-κB、HIF-1α均出現高表達，與空白組、含藥血清組和阻斷劑組比較，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01），說明當RGC-5細胞損傷出現時，會激活其中NF-κB表達，進一步激活HIF-1α表達，兩者可能形成正反饋的調節。SOD、MDA在模型組中表達升高（P<0.01），說明在視神經損傷后，細胞內活性氧增加，引發了SOD上調以及代謝產生MDA的集聚;另外，BNIP-3在模型組中高表達（P<0.01），說明在激活HIF-1α后，引發了BNIP-3途徑的線粒體自噬反應，有可能進而形成細胞凋亡。Hoechst法檢測到模型組細胞凋亡數量明顯多于其他各組（P<0.01），也驗證了這一點，且與前期研究的結果一致[4]。而與模型組相比，含藥血清組與阻斷劑組在谷氨酸致損后，其NF-κB表達均得到了一定的抑制，與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.05）;同時此兩組的HIF-1α表達也受到明顯抑制（P<0.01）;而含藥血清組與阻斷劑組之間并無明顯差異（P>0.05），表明含藥血清對RGC-5細胞產生了 組的BNIP-3蛋白表達和SOD含量均明顯受到抑制，表明含藥血清在抑制NF-κB和HIF-1α蛋白表達的基礎上，進一步抑制了BNIP-3和SOD的表達，前者可以減弱RGC-5細胞的線粒體自噬，對抑制RGC的凋亡有正向作用;而后者將導致MDA的減少，與本次實驗的結果吻合，最終形成了對細胞凋亡的抑制作用，表現為含藥血清組與阻斷劑組的細胞凋亡數量明顯減少（P<0.01）。

綜上所述，青光安Ⅱ號方含藥血清對谷氨酸誘導損傷的RGC-5細胞中NF-кB具有抑制作用，進而抑制了HIF-1α通路的激活，減弱了由于氧化應激所致的細胞凋亡。

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