石榴皮多酚乳膏抑制NLRP3炎性小體抗炎抗痤瘡的機制研究

高凡 朱明芳 楊逸璇 吳淑輝 李翠 張娟娟

〔摘要〕 目的 探究石榴皮多酚乳膏抑制NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3， NLRP3）炎性小體抗炎抗痤瘡的機制。方法 將42只雌雄各半SPF級SD大鼠隨機分為空白組、模型組、基質組、石榴皮多酚低中高濃度組、克林霉素組，每組6只。除空白組外，其余各組構建大鼠耳廓痤瘡模型。造模完成后于大鼠耳廓予各被試因素干預，2次/d，連續用藥2周，末次用藥24 h后取材。肉眼觀察皮損變化;HE染色觀察組織病理改變;免疫組化法檢測皮損中NLRP3、凋亡相關的斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD， ASC）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）、基質金屬蛋白酶2（matrix metallo proteinase-2， MMP-2）的表達情況;ELISA法檢測血清樣本中白細胞介素-1β（interleukin-1 beta， IL-1β）和白細胞介素18（interleukin-18， IL-18）的水平。結果 肉眼觀察可見空白組耳廓表面正常，模型組和基質組有皮膚暗紅、腫脹、變硬、痂皮及丘疹等炎癥表現，石榴皮多酚各濃度組及克林霉素組較模型組皮損可見不同程度改善。病理結果顯示，空白組組織正常，模型組及基質組表皮角化、真皮內炎癥細胞浸潤、皮脂腺增生，各治療組上述表現不同程度減輕。免疫組化示，與空白組相比，模型組和基質組大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1、MMP-2表達升高（P<0.05）;與模型組相比，石榴皮多酚各濃度組及克林霉素組NLRP3、Caspase-1水平明顯降低（P<0.05），石榴皮多酚中、高濃度組ASC表達降低（P<0.05），石榴皮多酚低、高濃度組MMP-2表達下降（P<0.05）。ELISA結果顯示，模型組較空白組大鼠血清IL-1β、IL-18含量明顯升高;石榴皮多酚各組及克林霉素組較模型組明顯下降（P<0.05）。結論 石榴皮多酚乳膏能有效改善SD大鼠痤瘡模型的炎癥反應，可能與其抑制NLRP3炎性小體抗炎抗痤瘡的機制有關。

〔關鍵詞〕 痤瘡;石榴皮多酚;炎癥反應;NLRP3炎性小體;白細胞介素-1β;白細胞介素-18

〔中圖分類號〕R275.9 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.07.006

〔Abstract〕 Objective To explore the anti-inflammatory and anti-acne mechanism of pomegranate peel polyphenol cream inhibiting NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3 （NLRP3） inflammatory corpuscle. Methods 42 male and female SPF SD rats were randomly divided into blank group， model group， matrix group， pomegranate peel polyphenol low-medium-high concentration group and clindamycin group， with 6 rats in each group. Except the blank group， the other groups established rat auricle acne model. After the completion of the model， the rats were intervened by various factors， twice a day， for 2 weeks， and the samples were taken 24 hours after the last administration. The changes of skin lesions were observed with naked eyes; histopathological changes were observed by HE staining; the expression levels of NLRP3， apoptosis-associated speck-like protein containing a card （ASC）， Caspase-1， matrix metalloproteinase-2 （MMP-2） were detected by immunohistochemistry; the levels of interleukin-1β （IL-1β） and interleukin-18 （IL-18） in serum samples were detected by ELISA. Results The auricle surface of blank group was normal， and the skin of model group and matrix group was dark red， swollen， hardened， scab and papule. Compared with model group， the skin lesions of pomegranate peel polyphenols and clindamycin group were improved in different degrees. Pathological results showed that the blank group was normal， while the model group and matrix group had keratinization of epidermis， infiltration of inflammatory cells in dermis and hyperplasia of sebaceous glands， which were alleviated in different degrees in each treatment group. Immunohistochemistry showed that compared with the blank group， the expression levels of NLRP3， ASC， Caspase-1 and MMP-2 in model group and matrix group were higher （P<0.05）; compared with the model group， the levels of NLRP3 and Caspase-1 in pomegranate peel polyphenol concentration groups and clindamycin group were significantly decreased （P<0.05）， ASC expression in pomegranate peel polyphenol middle and high concentration groups was decreased （P<0.05）， MMP-2 expression in pomegranate peel polyphenol low and high concentration groups was decreased （P<0.05）. The results of ELISA showed that the content of serum IL-1β and IL-18 in model group was significantly higher than those in blank group; compared with the model group， pomegranate peel polyphenol concentration groups and clindamycin groups decreased significantly （P<0.05）. Conclusion Pomegranate peel polyphenol cream can effectively improve the inflammatory response of SD rat acne model， which may be related to its anti-inflammatory and anti-acne mechanism of inhibiting NLRP3 inflammatory corpuscle.

〔Keywords〕 acne; pomegranate peel polyphenols; inflammatory reaction; NLRP3 inflammasome; interleukin-1β; interleukin-18

痤瘡是一種常見的毛囊及皮脂腺的慢性炎癥性皮膚病[1]。近年來痤瘡的發病率呈逐年上升的趨勢，面部痤瘡影響容貌，對患者工作生活造成嚴重的困擾，痤瘡的防治顯得尤為重要[2]。

炎性反應是痤瘡最原始的反應之一，而痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acnes， P. acnes）則在痤瘡炎癥維持過程中起主要作用[3]。研究發現，P. acnes在轉錄水平提高人真皮成纖維細胞基質金屬蛋白酶（matrix metallo proteinase-2， MMP-2）的表達，其過量繁殖促進MMP-2分泌，可能使毛囊壁更易破裂，炎癥擴散入真皮層。李曉娟等[3]研究發現P. acnes可通過依賴NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3， NLRP3）炎性小體的方式介導痤瘡患者單核細胞，通過分泌白介素-1β（interleukin-1 beta， IL-1β）來誘導痤瘡炎性反應的發生及發展。NLRP3炎性小體由NOD樣受體（NOD-like receptor， NLRs）凋亡相關的斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD， ASC）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）組成，其能夠識別多種內外源性刺激，通過招募并激活Caspase-1，促進促炎因子IL-1β和IL-18的剪切成熟與分泌，抑制細胞自噬，引起炎癥性凋亡等免疫效應[4]。

朱明芳教授基于中醫“以皮治皮”的“取類比象”思想，選用石榴皮治療痤瘡取得了較為顯著臨床療效。課題組前期研究證實了石榴皮的有效成分石榴皮多酚能在體外有效抗P. acnes[5]、抗疤痕[6]、調脂[7]等。基于此，本研究以SD大鼠構建痤瘡復合模型，外用石榴皮多酚乳膏進行干預，探討石榴皮多酚對NLRP3炎性小體及其相關通路的影響，初步闡明其抑制NLRP3炎性小體抗炎抗痤瘡的機制，為其臨床應用提供新的依據。

1 材料

1.1 ?實驗動物

SPF級成年SD大鼠42只，雌雄各半，體質量180～220 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（湘）2016-0002。動物飼養于中南大學實驗動物學部，實驗單位使用許可證號：SYXK（湘）2015-0017。飼養環境：室溫（24±2） ℃，相對濕度50%左右，通風，雌雄大鼠分籠飼養，自由攝水進食。本研究取得中南大學實驗動物福利倫理審查批準（編號：2019SYDW0134）。

1.2 ?藥品及試劑

石榴皮多酚提取物（濃度60%，批號：RY151119，西安瑞盈生物科技有限公司）;P. acnes標準菌株凍干粉（貨號：BNCC336443，北京北納創聯生物技術研究院）;100%油酸（批號：20190430，天津市富宇精細化工有限公司）;鹽酸克林霉素乳膏（貨號：H20040314，金日制藥有限公司）;MMP2兔多克隆抗體、NLRP3兔多克隆抗體、Caspase-1多克隆抗體（貨號：10373-2-AP、19771-1-AP、22915-1-AP，Proteintech公司）;ASC兔多克隆抗體（貨號：bs-6741R，北京博澳森生物技術有限公司）;IL-1β、IL-18的ELISA試劑盒（批號：200617R、200609R，江蘇菲亞生物科技有限公司）。

石榴皮多酚乳膏：按照參考文獻[6]制備乳膏基質，根據黃繼漢《藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算》[8]，計算大鼠低、中、高濃度石榴皮多酚用量分別為0.07 g/（d·kg）、0.14 g/（d·kg）、0.28 g/（d·kg），自制濃度分別為1.4%、2.8%、5.6%的低、中、高濃度石榴皮多酚乳膏。

P. acnes菌懸液：P. acnes凍干管于4 ℃下保存，打管后注入適量無菌水，多次吹打，充分溶解成菌懸液。涂布于硫乙醇鈉培養基中，于厭氧培養箱中37 ℃培養48 h后進行轉種活化。增殖后肉眼可見針尖至粟米大小、灰白色、表面光滑的菌落，進行革蘭染色檢查，于光學顯微鏡下可見微彎、呈棒狀、一端鈍圓、另一端尖細的G+桿菌，無芽孢，無莢膜，無鞭毛。收集菌落后洗滌、過濾，在細菌濁度儀下調整濃度為6×107 cfu/mL。

1.3 ?主要儀器

輪轉石蠟切片機（型號：RM2235，徠卡貿易有限公司）;正置熒光顯微鏡（型號：MoticPro285B，麥克奧迪實業集團有限公司）;雙目生物顯微鏡（型號：MoticBA410，麥克奧迪實業集團有限公司）;醫用低速離心機（型號：TD4-II，長沙平凡儀器儀表有限公司）;細菌濁度儀（編號：20161581，上海昕瑞儀器儀表有限公司）。

2 方法

2.1 ?分組及造模

大鼠適應性喂養1周后，按隨機數字表法分為空白組、模型組、基質組、石榴皮多酚低/中/高濃度組、克林霉素組，每組6只。除空白組外，其余各組按照參考文獻[9]建立大鼠耳廓痤瘡模型：于大鼠雙耳廓內側耳導管開口處均勻涂抹100%油酸，0.5 mL/次，1次/d，并于涂抹油酸的第21天開始在大鼠耳廓同一部位皮下注射P. acnes液（6×107 cfu/mL）50 μL，1次/d，連續3 d。末次注射P. acnes菌液24 h后，肉眼觀察耳廓皮膚狀態并記錄，各組隨機選擇一只大鼠取耳廓皮損部位組織進行病理觀察。參照痤瘡模型判定分級標準[10]進行造模評價，本實驗的造模評價為+++，見表1。

2.2 ?給藥方法

判斷造模成功后開始外用藥物，各組按被試因素分別于大鼠耳廓造模處連續用藥14 d，2次/d。空白組及模型組：予0.5 g蒸餾水;基質組：予基質乳膏0.5 g;石榴皮多酚低濃度組：予0.5 g 1.4%石榴皮多酚乳膏;石榴皮多酚中濃度組：予0.5 g 2.8%石榴皮多酚乳膏;石榴皮多酚高濃度組：予0.5 g 5.6%石榴皮多酚乳膏;克林霉素組：予0.5 g鹽酸克林霉素乳膏。

2.3 ?肉眼觀察皮損情況

自造模之日起，每日觀察大鼠耳廓皮膚，記錄其顏色，有無紅腫、表皮增厚、變硬、脫屑、痂皮、丘疹、囊腫及毛細血管擴張等炎癥表現，拍照記錄皮損的變化情況。

2.4 ?ELISA檢測血清IL-1β、IL-18水平

末次給藥24 h后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速采集腹主動脈血約5 mL，1 h靜置，3 000 r/min、半徑13.5 cm、離心15 min，取上清液后，-20 ℃冰箱內保存備用，ELISA法檢測外周血IL-1β、IL-18水平。

2.5 ?HE染色觀察病理組織結構

剪取大鼠耳廓組織，用磷酸鹽緩沖液沖洗數次后，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片、HE染色，95%乙醇快速清洗，脫水透明封片后，于顯微鏡下觀察。

2.6 ?免疫組化法檢測NLRP3、ASC、Caspase-1、MMP-2表達水平

石蠟切片脫蠟水化，加入適量內源性過氧化物酶阻滯劑，室溫下孵育10 min后，滴加適量稀釋的NLRP3兔多克隆抗體（1∶80），ASC兔多克隆抗體（1∶100），Caspase-1兔多克隆抗體（1∶100），MMP2兔多克隆抗體（1∶100），室溫放置1 h;PBS緩沖液沖洗3次后滴加適量反應增強液，室溫孵育20 min，PBS緩沖液沖洗3次后滴加適量增強酶標山羊抗鼠/兔IgG聚合物，室溫下孵育30 min;PBS緩沖液沖洗后再滴加DAB顯色劑，室溫下孵育5 min;復染、脫水、透明、封片、鏡檢，對測定組織中NLRP3、ASC、Caspase-1、MMP-2的平均光密度值進行比較分析。

2.7 ?統計學方法

應用SPSS 21.0軟件進行統計分析，若數據滿足正態性及方差齊性，則用單因素方差分析，進一步采用LSD法對各組間有統計學意義的數據進行組間比較，否則用秩和檢驗。計量資料以“x±s”表示，以P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 ?各組大鼠耳廓皮損情況

外用藥物14 d后，肉眼觀察大鼠耳廓皮損形態發現，空白組皮膚外觀呈淡粉色，耳廓輕薄，觸感柔軟，表面正常，無脫屑、腫脹;模型組和基質組大鼠耳廓皮膚暗紅、腫脹，表皮粗糙，有脫屑、痂皮、膿腫和小丘疹，觸感明顯變硬變厚;石榴皮多酚低、中、高濃度組紅腫、粗糙、脫屑及丘疹等情況均有不同程度減輕，以石榴皮多酚中、高濃度療效較明顯;克林霉素組炎癥明顯減輕，耳廓充血、膿腫和丘疹等大部分消退，可見少量脫屑。

3.2 ?各組大鼠耳廓病理改變

空白組大鼠耳廓鏡檢可見表皮細胞正常，皮脂腺無明顯增生，無明顯炎性細胞浸潤;模型組及基質組可見真皮內炎癥細胞彌漫性浸潤，皮脂腺增生明顯，毛囊口擴大，局部出血;石榴皮多酚低、中、高濃度組炎癥浸潤、皮脂腺增生、毛囊口擴大均有不同程度減輕，以中、高濃度最明顯;克林霉素組無明顯炎癥細胞浸潤，無明顯皮脂腺增生、擴大。見圖1。

3.3 ?各組大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1、MMP-2表達情況

NLRP3、ASC、Caspase-1、MMP-2主要分布在細胞質、細胞核、細胞間質上，見圖2。與空白組比較，模型組及基質組NLRP3、ASC、Caspase-1、MMP-2的表達均明顯升高（P<0.05）。與模型組比較，石榴皮多酚各組、克林霉素組NLRP3表達明顯下降（P<0.05），其中石榴皮多酚中濃度組下降最顯著（P<0.05）;石榴皮多酚低濃度組、克林霉素組ASC的表達差異無統計學意義（P>0.05），石榴皮多酚中、高濃度組ASC表達均有下降（P<0.05），其中石榴皮多酚高濃度組表達下降更為顯著（P<0.05）;石榴皮多酚各組、克林霉素組Caspase-1的表達明顯下降（P<0.05），其中克林霉素組下降最為顯著，其次為石榴皮多酚中、高濃度組（P<0.05），中、高濃度組間比較無明顯差異（P>0.05）;石榴皮多酚低、高濃度組MMP-2表達均有下降（P<0.05），石榴皮多酚中濃度組的表達差異無統計學意義（P>0.05），克林霉素組表達升高（P<0.05）。見表2。

3.4 ?各組大鼠IL-1β、IL-18表達水平

與空白組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-18炎癥因子水平明顯升高，差異具有統計學意義（P<0.05）。與模型組比較，石榴皮多酚各組、克林霉素組大鼠血清IL-1β炎癥因子水平明顯下降（P<0.05），其中克林霉素組下降最為顯著（P<0.05），其次為石榴皮多酚高濃度組（P<0.05），中、低濃度組組間無明顯差異（P>0.05）;石榴皮多酚各組、克林霉素組大鼠血清IL-18炎癥因子水平明顯下降（P<0.05），其中石榴皮多酚高濃度組及克林霉素組下降最明顯（P<0.05），高濃度組與克林霉素組組間無明顯差異（P>0.05），石榴皮多酚中、低濃度組組間無明顯差異（P>0.05）。見表3。

4 討論

痤瘡的病因復雜，其中P. acnes增殖引起的炎癥及免疫反應，是痤瘡的重要發病因素之一。研究[11-12]發現，P. acnes刺激的巨噬細胞、皮脂腺細胞及角質形成細胞顯著增加了IL-1β的釋放。李曉娟等[3]通過對痤瘡皮損中的炎性體的類型進行分型，并對暴露于P. acnes中的單核細胞分泌IL-1β的過程進行檢測，發現參與這一過程的是NLRP3炎性小體。NLRP3作為NLRP3炎癥體的傳感器成分，在先天免疫和炎癥中起著至關重要的作用，其可響應病原體和其他損傷的相關信號，啟動由NLRP3、ASC和Caspase-1組成的炎癥體聚合復合物的形成。ASC作為NLRP3炎性小體銜接蛋白，其磷酸化對炎癥激活起重要作用。Caspase-1在NLRP3炎性小體促炎作用中也尤為重要，NLRP3通過招募并激活Caspase-1，促進細胞外環境中IL-1β和IL-18的剪切成熟與分泌。IL-1β和IL-18與多種細胞因子協同作用，可抑制細胞自噬，引起炎癥性凋亡等免疫效應[13-14]。P. acnes增殖還可以促進基質金屬蛋白酶MMP-2分泌，MMP-2可以在P. acnes在組織中擴散的過程中造成細胞溶解和組織損傷，進一步介導痤瘡炎性反應的發生及發展[15]。一項對中國人群中NLRP3基因多態性與尋常型痤瘡的相關性研究[16]表明，NLRP3SNP rs10754558與尋常型痤瘡的發病顯著相關。由此推測，抑制NLRP3炎癥體介導的免疫炎癥反應或許是治療痤瘡的重要途徑。

“以皮治皮”是一種在中醫辨證論治指導下的思維方法，是指將經過加工處理過的動物或植物的皮作為藥物來治療皮膚病的方式。本課題組前期以“以皮治皮”理論為核心著重研究了石榴皮治療痤瘡的療效，研究發現其可顯著減少痤瘡患者丘疹的發生，改善皮膚紅腫及干燥脫屑等情況，并能長久保持皮膚水潤美白[17-18]，且患者滿意度高。石榴皮多酚是石榴皮中的主要有效成分，大量研究已證實石榴皮多酚具有抗氧化、抗菌、抗過敏、促進皮膚愈合等功效，其在其他疾病中的應用也已得到廣泛研究[19-22]。課題組前期研究還證實了石榴皮多酚能在體外抗P. acnes、抗疤痕、調脂、保濕等功效[5-7]。現進一步探索其是否可以通過調節NLRP3炎性小體相關的通路抑制炎癥免疫反應來治療痤瘡。

本研究表明，石榴皮多酚乳膏的局部應用可以減少NLRP3炎性體的激活有效抑制P. acnes增殖引起的痤瘡。經石榴皮多酚干預后，與模型組相比，石榴皮多酚各組及克林霉素組大鼠耳部表皮粗糙、發紅、腫脹、丘疹等炎癥表現減輕，炎性細胞浸潤及皮脂腺增生減少，血清促炎因子IL-1β、IL-18水平也明顯下降，說明石榴皮多酚乳膏具有良好的抗炎效果。免疫組化結果提示，與模型組相比，石榴皮多酚各組及克林霉素組NLRP3、Caspase-1表達明顯降低，中、高濃度組ASC水平明顯下降（P<0.05），低、高濃度組MMP-2表達下降（P<0.05），說明石榴皮多酚乳膏治療作用可能與降低痤瘡組織中NLRP3、ASC、Caspase-1、MMP-2表達量有關。由此推測，石榴皮多酚乳膏可以通過抑制NLRP3炎性小體及其相關通路達到抗炎抗痤瘡的作用。

本研究探討了石榴皮多酚對NLRP3、ASC、Caspase-1、MMP-2、IL-1β及IL-18的影響，為闡明石榴皮多酚乳膏治療痤瘡的作用機制奠定了基礎，為痤瘡的非抗生素治療提供了新思路及實驗依據。痤瘡的發病機制復雜，石榴皮多酚是否還對痤瘡發病過程的其他環節有干預作用有待進一步的研究。

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