薯蕷丸調控HIF-1α與p53表達改善線粒體損傷治療肝細胞癌的實驗研究

鄧哲 歐陽昭廣 胡玉星 馮婷 陳錚甲 寧迪敏 張博宇 雷宜晨 劉華 田雪飛

〔摘要〕 目的 觀察薯蕷丸對腫瘤微環境中HIF-1α與p53的表達以及線粒體損傷的影響，及其對肝細胞癌的治療作用。方法 制備人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，雄性BALB/c裸鼠（n=24， 5周齡），隨機分為4組，每組6只：模型組（0.9%生理鹽水0.2 mL/d）、薯蕷丸組（薯蕷丸0.4 g/d），薯蕷丸+順鉑組（薯蕷丸0.4 g/d+每周腹腔注射順鉑5 mg/kg）、順鉑組（每周腹腔注射順鉑5 mg/kg）。每只裸鼠灌胃劑量為0.2 mL/d，每2天測量1次腫瘤體積與小鼠體質量，連續干預14 d后脫頸處死，剝離皮下移植瘤;電鏡下觀察腫瘤組織線粒體結構和數量;Western blot與RT-qPCR法分別檢測人肝癌裸鼠皮下移植瘤中HIF-1α、p53的蛋白及mRNA表達。結果 與模型組相比，薯蕷丸組可抑制人肝癌裸鼠皮下移植瘤的生長，抑制HIF-1α的mRNA與蛋白表達（P<0.05），上調抑癌基因p53的mRNA與蛋白表達（P<0.05），同時改善線粒體結構損傷;與薯蕷丸組或順鉑組相比，薯蕷丸聯合順鉑組對HIF-1α、p53基因表達及改善線粒體結構作用更顯著（P<0.05）。結論 薯蕷丸可通過促使HIF-1α的失活與p53的活化，改善線粒體結構損傷，從而抑制人肝癌裸鼠皮下移植瘤的生長，與順鉑聯用后具有協同增效作用。

〔關鍵詞〕 肝癌;腫瘤微環境;薯蕷丸;線粒體損傷;HIF-α;p53

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.07.007

〔Abstract〕 Objective To evaluate the effect of Shuyu Pills on the expression of HIF-1α and p53 in tumor microenvironment and mitochondrial damage， and therapeutic effect on treating hepatocellular carcinoma （HCC）. Methods The subcutaneously transplanted tumor model of human hepatocellular carcinoma in nude mice was prepared. Male BALB/c nude mice （n=24， 5 weeks old） were randomly divided into 4 groups with 6 mice in each group： model group （administered normal saline， 0.2 mL/d）， SYP group （0.4 g/d Shuyu Pills）， SYP+DDP group （0.4 g/d Shuyu Pills + weekly intraperitoneal dose of 5 mg/kg cisplatin）， DDP group （weekly intraperitoneal dose of 5 mg/kg cisplatin）. Each mouse was taken 0.2 mL drug via gavage every day. The tumor volume and body weight of mouse were measured every 2 days. After continuous intervention for 14 days， all the mice were sacrificed by neck removal and subcutaneous graft tumor was removed; the structure and quantity of mitochondria in tumor tissues were observed by electron microscopy; the protein and mRNA expression levels of HIF-1α and p53 of tumor were detected by Western blot and RT-qPCR. Results Compared with model group， SYP group inhibited the growth of subcutaneous transplanted tumor of HCC in nude mice， inhibited the mRNA and protein expression of HIF-1α （P<0.05）， upregulated the mRNA and protein expression of tumor suppressor gene p53 （P<0.05）， and improved the mitochondrial structure damage; compared with SYP group or DDP group， SYP+DDP group improved the expression of HIF-1α and p53 genes and mitochondrial structure significantly （P<0.05）. Conclusion Shuyu Pills could inhibit the growth of subcutaneously transplanted human HCC in nude mice， which might inactivate HIF-1α and activate p53， to improve mitochondrial structural damage， combined with cisplatin， Shuyu Pills has synergistic effect.

〔Keywords〕 hepatocellular carcinoma; tumor microenvironment; Shuyu Pills; mitochondrial damage; HIF-1α; p53

肝細胞癌（hepatocarcinoma， HCC）是臨床常見的惡性腫瘤之一，其發病率、死亡率分別位居全球惡性腫瘤第6位與第4位[1]。缺氧是實體瘤中的常見現象，可誘導腫瘤能量代謝重編程[2]。代謝異常是腫瘤的重要特征，正常細胞在氧氣充足的情況下利用線粒體的氧化磷酸化產生ATP，為細胞的生命活動提供能量，而在氧氣不足的情況下則轉變為利用糖酵解的方式。在多數腫瘤中，無論處于有氧還是缺氧環境，都要保證一定程度的糖酵解反應作為產能方式，這被稱為有氧糖酵解過程，即Warburg效應，也是腫瘤細胞獨有的代謝特征之一[3]。腫瘤細胞糖酵解過程不僅為腫瘤細胞提供維持生長的能量，其合成的乳酸、核苷酸等一系列產物還為腫瘤細胞增殖、轉移過程提供了必需的內源性生物原料[4]。也有研究[5]認為是因為腫瘤細胞中線粒體含量減少了20%～50%的原因導致OXPHOS的降低，這一理論進一步擴展支持了Warburg的假說。線粒體的代謝受一系列基因的調控，腫瘤發生的早期處于缺氧微環境，使得HIF-1、p53、NF-κB等基因的表達變化，導致線粒體的氧化磷酸化受到抑制，細胞主要以糖酵解的形式獲得能量[6-7]。肝臟作為一個高度再生的器官，肝細胞中包含大量的線粒體以供能，線粒體代謝重編程在肝癌發生發展中起重要作用，肝臟線粒體代謝異常是公認的致癌因素之一[8]。因此，抑制腫瘤缺氧相關基因的表達，改善線粒體的損傷，有助于抑制腫瘤細胞的有氧糖酵解，恢復線粒體的氧化磷酸化功能，抑制腫瘤的進展。

低氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1， HIF-1α）是HCC細胞適應低氧微環境的重要調節因子，影響HCC細胞的生長繁殖、侵襲轉移、血管新生、耐藥、凋亡等過程[9-10]。研究[2]發現，HIF-1α的表達可降低線粒體的合成，從而導致細胞氧耗的減少。另外，抑癌基因p53的突變、表達下調或缺失，也可作用于線粒體代謝，使線粒體呼吸轉變為糖酵解模式[11]。因此，抑制HIF-1α的表達與p53的失活，有望改善肝癌細胞線粒體代謝重編程，抑制糖酵解的發生。研究[12]發現，脾虛模型大鼠中多器官的線粒體含量明顯減少，形狀異常，結構紊亂，基質改變。通過改善脾虛進而改善線粒體在臟器中的合成與代謝，有望從改善代謝方式的角度控制腫瘤的進展。而線粒體生物合成、能量代謝功能的正常發揮與中醫“脾為后天之本”的功能密切相關[12-13]，薯蕷丸出自東漢張仲景《金匱要略·血痹虛勞病》：“虛勞諸不足，風氣百疾，薯蕷丸主之”，功用健脾益氣和營，因脾氣虧虛導致的虛勞百疾皆可用之。現代研究[14-15]表明，薯蕷丸具有改善能量代謝與免疫功能、輔助治療腫瘤等多個方面的作用。為了探究薯蕷丸是否通過保護線粒體發揮調控HCC細胞能量代謝的作用，我們將薯蕷丸與順鉑聯合運用，通過研究薯蕷丸對代謝相關基因HIF-1α與p53的調控，以及線粒體損傷的影響，觀察其對HCC的輔助治療作用。

1 材料與方法

1.1 ?主要試劑

胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司，貨號：T1320）;高糖DMEM培養基（美國Hyclone公司，貨號：AE29005267）;胎牛血清（美國Gibco公司，貨號：2176404）;水合氯醛（貨號：20180622）、無水乙醇（貨號：GB/T678-2002）（上海國藥集團化學試劑有限公司）;青霉素（貨號：408G021）、鏈霉素（貨號：70100900）（北京索萊寶科技有限公司）;環氧丙烷（上海邁瑞爾化學技術有限公司，貨號：M25514）;鋨酸（貨號：18456）、DDSA（貨號：18022）、NMA（貨號：18032）、DMP30（貨號：18042）（美國TED PELLA INC公司）;戊二醛（北京雷根生物技術有限公司，貨號：DF0156）;HIF-1α小鼠抗人單克隆抗體（貨號：ab1）、p53小鼠抗人單克隆抗體（英國Abcam公司，貨號：ab26）;β-actin小鼠抗人單克隆抗體（美國proteintech公司，貨號：66009-1-Ig）;HRP標記山羊抗小鼠IgG抗體（美國proteintech公司，貨號：SA00001-1）;RIPA裂解液（中國上海碧云天有限公司，貨號：P0013B）;SuperECL Plus超敏發光液（美國Advansta公司，貨號：K-12045-D50）;顯影液（貨號：BW-61）、定影液（貨號：BW-62）（中國上海佳信公司）;TEMED（中國上海阿拉丁公司，貨號：T105497）;SDS（貨號：MB2479）、EDTA（中國大連美倫生物技術有限公司，貨號：MB2514）;瓊脂糖（西班牙BIOWEST公司，貨號：111860）;mRNA逆轉錄試劑盒（貨號：CW2569）、miRNA逆轉錄試劑盒（貨號：CW2141）、上樣緩沖液（貨號：CW0610）、UltraSYBR Mixture（貨號：CW2601）、DM2000 Plus DNA Marker（貨號：CW0632）（中國北京康為世紀公司）;Tris（貨號：V900483）、DEPC（美國Sigma公司，貨號：D5758）;Trizol（美國Thermo公司，貨號：15596026）;核酸染料（中國北京普利萊，貨號：PB11141）。

1.2 ?藥物

薯蕷丸使用中藥配方顆粒，藥物組成及生產批號：山藥（0090443）24 g，當歸（0103203） 6 g，桂枝（0116553） 6 g，建曲（0091033） 6 g，生地黃（0113523） 12 g，人參（0115203） 6 g，炙甘草（0112233） 12 g，川芎（0125883） 6 g，白芍（0121933） 6 g，白術（0111433） 6 g，麥冬（0121693） 6 g，苦杏仁（0112663） 6 g，柴胡（0110723） 6 g，桔梗（0101183） 3 g，茯苓（0110753） 6 g，阿膠（0112143） 6 g，干姜（0115493） 3 g，防風（0101983） 6 g，白蘞（0086073） 6 g，大棗（0111143）24 g，所有藥物購自廣東一方制藥有限責任公司。將藥物用溫水溶解后，振蕩制備成混懸液。根據薯蕷丸的藥理學劑量規定，成人薯蕷丸日劑量為156 g/d，小鼠體質量約為20 g，根據人鼠體表面積換算，小鼠給藥劑量為0.4 g/d。順鉑注射液（DDP）（齊魯制藥有限公司，貨號9E0214B02）：5 mg/kg，每周1次，腹腔注射。

1.3 ?細胞與動物分組

采用HCC細胞株SMMC-7721，購自中南大學湘雅醫學院細胞中心。BALB/c無胸腺裸鼠（雄性，5周齡），購自上海斯萊克實驗動物有限公司（生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005），所有動物飼養在無特定病原體（specific pathogen free， SPF）級環境中，可自由地獲取食物和水，并進行12 h/12h的明/暗循環。將1×107個SMMC-7721細胞接種于每只裸鼠右上肢后側，建立人HCC裸鼠皮下移植瘤模型。實驗從可觸及裸鼠皮下移植瘤開始（腫瘤體積約為100 mm3），造模成功后，隨機分為4組，每組6只，分別為：模型組（0.9%生理鹽水0.2 mL/d）、薯蕷丸組（薯蕷丸0.4 g/d）、薯蕷丸+順鉑組（薯蕷丸0.4 g/d+每周腹腔注射順鉑5 mg/kg）、順鉑組（每周腹腔注射順鉑5 mg/kg）。每只裸鼠灌胃劑量為0.2 mL/d。

1.4 ?觀察指標

1.4.1 ?腫瘤體積測定 ?每2天測量1次腫瘤體積，腫瘤體積計算公式為：（最大腫瘤長度×寬度2）/2[16]。連續干預14 d后，根據《實驗動物：福利倫理審查指南》[17]對小鼠進行頸椎脫位安樂死，剝離皮下移植瘤并進行檢測。所有實驗動物均得到悉心照料，本實驗通過中南大學實驗動物福利倫理審查委員會批準。

1.4.2 ?透射電子顯微鏡成像 ?為了檢測線粒體的超微結構變化，在用薯蕷丸或順鉑處理14 d后，收集人HCC裸鼠皮下移植瘤組織用于樣品制備。實驗步驟：（1）固定;取1 cm3組織塊若干塊，在4 ℃下用2.5%戊二醛在黑暗中進行12 h的初次固定，然后將組織在1%鋨酸中固定1 h。（2）脫水：在分級乙醇系列（30%、50%、70%、80%、95%和100%）和環氧丙烷中進行脫水。（3）浸透：在環氧丙烷和環氧樹脂中浸泡2 h，然后純環氧樹脂中浸泡3 h。（4）包埋：用純環氧樹脂包埋后入40 ℃烤箱烘烤12 h和60 ℃烤箱烘烤48 h。（5）切片：使用徠卡Ultracut UCT切片機以80 nm切片厚度用金剛石刀具切割超薄切片，將切片置于300目銅網上。（6）染色：電子染色（鉛、鈾染色）。（7）拍照：日立7700型透射電鏡觀察，用數碼相機記錄圖像。

1.4.3 ?Western blot檢測蛋白表達水平 ?采用Western blot方法檢測人HCC裸鼠皮下移植瘤中HIF-1α與p53的蛋白表達。實驗步驟：（1）蛋白提取：剪取25 mg組織，用冰預冷PBS洗滌組織，加入300 μL RIPA裂解液以裂解10 min;離心后將上清液轉移入離心管。（2）制膠：在10%分離膠中加入TEMED后立即搖勻灌膠，異丙醇封膠。膠凝后倒去膠上層異丙醇并用濾紙將其吸干。在4.8%濃縮膠中加入TEMED后搖勻灌膠。將梳子插入玻璃板中，剩余空間灌滿濃縮膠，等待膠凝固。（3）樣品準備：在200 μL蛋白上清中加入50 μL 5×loading buffer混勻，沸水煮5 min，冰盒速冷備用。（4）電泳：據蛋白定量結果，第一孔點入marker 2 μL，其他每孔上樣50 μg已變性蛋白。開始電泳，電泳恒定電壓75 V，時間為130 min。待溴酚藍電泳至膠底部，終止電泳。（5）轉膜：分別切膠PD-1（50-55 kDa）、PD-L1（33 kDa）、CD4（55 kDa）、CD8（35 kDa）、 HIF-1α（120 kDa）、p53（53 kDa）、β-actin（42 kDa）。（6）封閉：用1×PBST配制5%脫脂奶粉，將膜浸入后室溫靜置60 min，在4 ℃下過夜后室溫靜置30 min。（7）一抗孵育：加入一抗Mouse anti-HIF-1α antibody（ab1），1∶200;Mouse anti-HIF-1α antibody（ab26），1∶500;Mouse anti-β-actin antibody（66009-1-Ig），1∶5 000，室溫放置90 min。孵育結束后用1×PBST洗3次，每次15 min。（8）二抗孵育：加入二抗（HRP goatanti-mouse IgG， SA00001-1，1∶5 000;HRP goat anti-rabbit IgG， SA00001-2，1∶6 000），室溫孵育90 min后，1×PBST洗3次，每次10 min。（9）ECL顯色曝光：使用ECL化學發光液與膜孵育1 min，用濾紙吸盡液體，用塑封膜將膜包裹雜交膜，在暗盒內與X膠片曝光后顯影沖洗。

1.4.4 ?RT-qPCR檢測蛋白表達水平 ?采用RT-qPCR法檢測人HCC裸鼠皮下移植瘤中HIF-1α與p53的mRNA表達。按照說明書使用TRIzol試劑從SMMC7721細胞中提取總RNA。然后以總mRNA為模板，用cDNA逆轉錄酶進行逆轉錄。定量PCR擴增程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，40個循環，熔解曲線分析：60～95 ℃。引物設計：在NCBI上搜索目的基因的序列，運用Primer 5軟件設計引物，由上海生工合成引物。使用的引物如下：β-actin：F-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC和R-TACTCCTGCTTGCTGATCCAC，基因產物223 bp;P53：F-CCCCTGTCATCTTTTGTCCCT和R-AGCTGGCAGAATAGCTTATTGAG，基因產物137 bp;HIF-1α：F-TCCAGCAGACCCAGTTACAGA和R-GCCACTGTATGCTGATGCCTT，F-GCACCCCAAGGCAAAAATCG，基因產物182 bp。

1.5 ?統計學分析

使用統計學軟件SPSS 25.0分析數據，所有實驗樣本均重復3次，計量資料以“x±s”表示。用t檢驗進行兩組間數據比較，多組比較采用單因素方差分析，多組間數據比較采用LSD方法檢驗判定統計學差異，以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 ?薯蕷丸對人HCC裸鼠皮下移植瘤生長的影響

體外腫瘤生長圖顯示，與模型組相比，薯蕷丸組、薯蕷丸聯合順鉑組的瘤體皆有縮小。與模型組相比，薯蕷丸組、薯蕷丸聯合順鉑組、順鉑組腫瘤體積縮小，差異具有統計學意義（P<0.05）;與薯蕷丸組或順鉑組相比，薯蕷丸聯合順鉑組對腫瘤體積的抑制作用增強，差異具有統計學意義（P<0.05）。見圖1。

2.2 ?薯蕷丸對HIF-1α、p53基因蛋白及mRNA表達的影響

HIF-1α基因的蛋白表達結果顯示，與模型組相比，薯蕷丸組、順鉑組中癌基因HIF-1α的蛋白表達下降，差異具有統計學意義（P<0.05），且薯蕷丸聯合順鉑組差異更加顯著（P<0.01）。HIF-1α基因的mRNA熒光定量表達結果顯示，與模型組相比，薯蕷丸組、薯蕷丸聯合順鉑組、順鉑組中的HIF-1α的mRNA表達下降，差異具有統計學意義（P<0.01）;與薯蕷丸組相比，薯蕷丸聯合順鉑組差異具有統計學意義（P<0.05）。p53基因的蛋白表達結果顯示，與模型組相比，薯蕷丸組中p53的蛋白表達上調，差異具有統計學意義（P<0.05），且薯蕷丸聯合順鉑組、順鉑組差異更加顯著（P<0.01）;與薯蕷丸組和順鉑組相比，薯蕷丸聯合順鉑組差異具有統計學意義（P<0.05）。p53基因的mRNA熒光定量表達結果顯示，與模型組相比，薯蕷丸組、薯蕷丸聯合順鉑組、順鉑組中p53的mRNA熒光定量表達上調，差異具有統計學意義（P<0.01）;與薯蕷丸組和順鉑組相比，薯蕷丸聯合順鉑組差異具有統計學意義（P<0.01）。見圖2。

2.3 ?線粒體結構觀察

電鏡下人HCC裸鼠皮下移植瘤中線粒體結構顯示，模型組線粒體數量較少，線粒體變性，嵴狀結構排列紊亂且大多已斷裂，可見線粒體固縮，膜結構完整;薯蕷丸組線粒體數量多，線粒體嵴狀結構部分損傷，但可見排列結構，部分線粒體固縮，膜結構完整;薯蕷丸聯合順鉑組線粒體數量較多，線粒體嵴狀結構排列整齊，結構清晰，線粒體未固縮，膜結構完整;順鉑組線粒體數量多，線粒體嵴狀結構部分損傷，但可見排列結構，部分線粒體固縮，膜結構部分損傷。見圖3。

3 討論

中醫認為肝癌的病機為本虛標實，本虛因長期癌毒內耗，加之手術、放化療等損傷性治療，易導致機體氣血虛衰，臟腑功能衰退，全身代謝功能紊亂，免疫功能低下。治療上，中醫以“攻補兼施、扶正祛邪”為主要原則[18]。薯蕷丸治療“虛勞諸不足，風氣百疾”，根據脾為后天之本的思想，針對肝癌本虛標實的特點，可以將健脾扶正法作為肝癌輔助治療的切入點[19]。現代研究[20-21]也表明，薯蕷丸及方內組分具有抗氧化、改善機體能量代謝、增強免疫、輔助抗腫瘤等多方面的作用。

缺氧是實體瘤的重要生物學特征，腫瘤微環境缺氧可誘導線粒體代謝從氧化磷酸化轉變成糖酵解模式，這是腫瘤細胞線粒體代謝重編程的重要表現形式[22]。研究[8]顯示，線粒體的損傷與含量減少是導致氧化磷酸化轉向糖酵解模式的原因，而肝臟線粒體代謝異常是重要的致癌因素。腫瘤微環境的低氧可誘導線粒體酶的表達發生改變，導致線粒體代謝異常，其機制可能與 HIF-1α或p53基因的作用有關[23]。研究[24]顯示，缺氧可通過過表達或穩定HIF-1來促進HCC進展和侵襲。HIF-1α的表達可降低線粒體的合成，從而導致細胞氧耗的減少[5]。研究[25-26]發現HIF-1α在HCC組織中高表達，通過不斷激活與HCC生長相關的多種靶基因，參與HCC的微血管新生、能量代謝、增殖、侵襲轉移、凋亡等過程，可促進HCC的發生發展，而抑制HIF-1α表達有利于控制HCC細胞侵襲和轉移能力。另外，抑癌基因p53可活化PFK-2的亞型-TP53誘導糖酵解和凋亡調節因子（TIGAR），TIGAR降低了果糖-2，6-磷酸的表達水平，從而起到抑制糖酵解的作用[5]。但在腫瘤細胞中，p53基因常出現突變、表達下調或缺失，p53的失活可使代謝從氧化磷酸化轉變到糖酵解模式[27-28]。因此，癌基因HIF-1α的活化與抑癌基因p53的失活，可誘導腫瘤微環境的缺氧，導致能量代謝從氧化磷酸化向糖酵解的轉變，從而促進HCC的發生發展，其機制可能與線粒體的合成受損相關，靶向調控HIF-1α與p53有助于改善線粒體損傷，控制腫瘤的進展。

本實驗研究結果表明，薯蕷丸具有抑制人HCC裸鼠皮下移植瘤生長的作用，而薯蕷丸與順鉑聯合運用以后，其抑瘤作用更為顯著。為了進一步明確其作用機制，本研究檢測了人HCC裸鼠皮下移植瘤中HIF-1α與抑癌基因p53的表達，同時，在電鏡下觀察了各組皮下移植瘤中線粒體的結構。結果表明，薯蕷丸具有抑制缺氧誘導因子HIF-1α與活化抑癌基因p53表達的作用，同時改善了線粒體的結構破壞，薯蕷丸與順鉑兩者聯用具有協同作用。因此，猜測薯蕷丸可能通過促使HIF-1α失活與抑癌基因p53活化的作用，進一步保護線粒體結構，改善腫瘤微環境的能量代謝，從而發揮抗HCC的作用。此外，研究結果發現薯蕷丸與順鉑聯用以后具有協同增效作用，有報道顯示，缺氧微環境促進腫瘤對放化療抵抗和耐藥[17]。另一方面，研究[29]顯示線粒體參與順鉑的耐藥性，改善線粒體功能可增強順鉑對腫瘤化療的敏感性。并且，調控HIF-1α與p53的表達，有助于控制腫瘤細胞的順鉑耐藥[30]。因此，薯蕷丸可能通過調控HIF-1α與p53改善了腫瘤微環境的缺氧，并且通過改善線粒體的功能，增強了HCC細胞對順鉑的敏感性，從而發揮了協同增效的作用，這為我們今后進一步對HCC的化療增敏作用研究提供啟發。

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