加味椒艾丸貼敷神闕穴對輪狀病毒腹瀉小鼠NOD1/NF-κB信號通路的影響

肖瑤 劉百祥 封迎帥 余闐 吳海金 袁利群

〔摘要〕 目的 觀察加味椒艾丸貼敷神闕穴對輪狀病毒腹瀉小鼠NOD1/NF-κB信號通路的影響，探討其干預輪狀病毒感染性腹瀉的機制。方法 將40只SPF級ICR乳鼠中的10只分為正常對照組，其余30只采用猴輪狀病毒SA11株懸液灌胃造模2 d，造模成功后隨機分為模型組、丁桂貼組、加味椒艾丸組，每組10只。藥物干預敷貼連續5 d，末次給藥并禁食12 h后取材。收集各組小鼠糞便進行糞便評分;ELISA檢測各組血清TNF-α、IL-1β、Caspase-1含量;Western blot檢測各組小鼠小腸組織p65、NF-κB蛋白表達;HE染色觀察各組小鼠腸組織病理形態。結果 （1）與正常對照組比較，模型組小鼠糞便評分明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，丁桂貼組和加味椒艾丸組糞便評分明顯降低（P<0.05）。（2）與正常對照組比較，模型組血清中TNF-α、Caspase-1含量明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，丁桂貼組及加味椒艾丸組TNF-α、Caspase-1含量明顯下降（P<0.05，P<0.01）;與加味椒艾丸組比較，丁桂貼組Caspase-1含量明顯降低（P<0.01）。（3）與正常對照組比較，模型組p65、NF-κB蛋白表達升高（P<0.01）;與模型組比較，丁桂貼組、加味椒艾丸組p65、NF-κB蛋白表達降低（P<0.05，P<0.01）。（4）正常對照組小鼠回腸和結腸黏膜上皮未見異常;模型組小鼠回腸和結腸黏膜上皮變性壞死，部分黏膜上皮缺失，且伴有不同程度的黏膜層血管擴張;丁桂貼組和加味椒艾丸組小鼠回腸和結腸黏膜上皮部分缺失，黏膜層血管少量擴張。結論 加味椒艾丸貼敷神闕穴能改善輪狀病毒腹瀉癥狀，可能通過降低血清中TNF-α、Caspase-1含量及小腸組織中p65、NF-κB蛋白表達來調控NOD1/NF-κB信號通路。

〔關鍵詞〕 輪狀病毒腹瀉;加味椒艾丸;神闕穴;敷貼;NOD1/NF-κB信號通路;糞便評分

〔中圖分類號〕R256.34 ? ? ?〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.07.012

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Jiawei Jiaoai Pills applied to Shenque （RN8） acupoint on NOD1/NF-κB signalling pathway of rotavirus diarrhea rats， and to explore the mechanism in treating rotavirus diarrhea. Methods The 10 of 40 SPF neonatal rat randomly selected as the control group， the remaining 30 rats by gastric perfusion of suspension of simian rotavirus SA11 strain for two days to establishment of rotavirus diarrhea rat model， which rats were randomly divided into the model group， Dinggui application group and Jiawei Jiaoai Pills group， with 10 rats in each group. The drug intervention application continued for 5 days. The samples were taken from the 12 hours after the last acupoint application. The feces of mice in each group were collected for diarrhea score; the content of serum TNF-α， IL-1β， Caspase-1 was detected by ELISA; the expression levels of p65， NF-κB were analyzed by Western blot; HE staining was used to observe the pathological morphology of intestinal tissues in each group. Results （1） Compared with the control group， faeces score of model group was significantly increased （P<0.01）; compared with the model group， faeces score was obvious decreased in the Dinggui application group and Jiawei Jiaoai Pills group （P<0.05）. （2） Compared with the contorl group， the levels of serum TNF-α， Caspase-1 were significantly reduced in model group （P<0.01）; compared with the model group， the levels of serum TNF-α， Caspase-1 were obvious decline in the Dinggui application group and Jiawei Jiaoai Pills group （P<0.05， P<0.01）; compared with Jiawei Jiaoai Pills group， the level of Caspase-1 was declined in the Dinggui application group （P<0.01）. （3） Compared with the control group， the expression levels of p65， NF-κB were higher in model group （P<0.01）; compared with the model group， the expression levels of p65， NF-κB were declined in the Dinggui application group and Jiawei Jiaoai Pills group （P<0.05， P<0.01）. （4） There was no abnormality in the ileum and colon mucosal epithelium in the control group， while the ileum and colon mucosal epithelium in the model group was degenerated and necrotic， with partial loss of mucosal epithelium and accompanied by different degrees of vascular dilatation in the mucosal layer. Mucosal epithelium of ileum and colon in Dinggui application group and Jiawei Jiaoai Pills group were partially absent， and blood vessels of mucosal layer were slightly dilated. Conclusion Jiawei Jiaoai Pills applied to Shenque （RN8） acupoint can improve the diarrhea symptoms of rotavirus diarrhea of rats， and regulate NOD1/NF-κB signaling pathway by down regulating the protein expression of serum TNF-α， Caspase-1 and intestinal tissue p65， NF-κB.

〔Keywords〕 rotavirus diarrhea; Jiawei Jiaoai Pills; Shenque （RN8） acupoint; NOD1/NF-κB signaling pathway; faeces score

輪狀病毒（rotavirus， RV）是全球嬰幼兒腹瀉最常見的病原體，是兒童腹瀉的主要原因，尤其是3歲以下兒童發病率較高[1-2]。RV感染的急性腹瀉嬰幼兒會伴有明顯腸道菌群失衡、血清炎癥因子水平升高現象，其發病主要原因是自身免疫功能降低，病原微生物入侵，導致炎癥感染，RV感染性腸炎在一定程度上會導致呼吸、心肌及神經系統損害[3-4]。目前，對于RV腹瀉并無特效藥物，近年來，研究[5-6]表明，中醫藥在治療腹瀉方面具有一定的臨床療效。治療RV腹瀉的早期臨床研究[7-8]表明，加味椒艾丸穴位貼敷涌泉穴或神闕穴治療嬰幼兒RV腹瀉較貼臍療效更優，能縮短病程，并且在治療嬰幼兒急性腹瀉的臨床療效優于單純西醫治療。但加味椒艾丸穴位貼敷治療RV腹瀉具體作用機制尚不明確，本次動物實驗通過研究加味椒艾丸貼敷神闕穴對RV腹瀉小鼠的NOD1/NF-κB信號通路的影響，從分子生物學水平闡明加味椒艾丸貼敷治療RV腹瀉的作用機制，為臨床治療RV腹瀉提供理論依據。

1 材料

1.1 ?動物

SPF級ICR乳鼠40只，鼠齡9～10 d，體質量（7.9±0.4） g，動物倫理審批號：2020（3）009，許可證號：SYXK（湘）2020-0015。實驗前所有乳鼠糞便予RV抗原快速檢測試劑檢測結果為陰性，乳鼠由湖南省人民醫院臨床研究所實驗動物中心提供。

1.2 ?RV毒種及增殖

感染病毒為猴RV細胞系（RV SA11株），由湖南省人民醫院臨床研究所實驗動物中心提供。羅猴胎腎細胞MA104細胞系用于病毒增殖（批號：HZ-CC100930，武漢華美生物工程有限公司）

1.3 ?藥物

加味椒艾丸藥物組成：川椒、干姜、赤石脂、烏梅、熟艾、黃連、黃芩、檳榔，均由藥劑專業人員專門采購，以上8味藥各3 g等比配伍，研磨成粉備用，用醋調勻成糊狀封存，使用時制成直徑0.5 cm×0.5 cm，質量約0.5 g的藥帖，置于醫用膠布上備用[9]。加味椒艾丸（湖南振興中藥有限公司），丁桂兒臍貼1.6 g/貼（批號：2002901A，亞寶藥業集團股份有限公司）。

1.4 ?主要試劑

小鼠RV抗原ELISA試劑盒（批號：CSB-EQ027718MO）、Caspase-1 ELISA試劑盒（批號：CSB-EL004543MO）、小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒（批號：CSB-E04741m）、小鼠白介素1β（IL-1β）ELISA試劑盒（批號：CSB-E08054m）均購自武漢華美生物工程有限公司;A群RV抗原檢測試劑盒[批號：2020101285，英科新創（廈門）科技有限公司];兔抗NF-κB1多克隆抗體（批號：13586，美國CST公司）;p65[批號：sc-8008，圣克魯斯生物技術（上海）有限公司]。

1.5 ?主要儀器

352型酶標儀、AC8型洗板機均購自上海雷勃生物技術有限公司;TG16W型微量高速離心機（湘儀離心機儀器有限公司）;GNP-9080型隔水式恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）;PP-1105型電泳儀（北京凱元信瑞儀器有限公司）;TGL-16c型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）;TGL-16型冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）;L4158型掃描儀[愛普生（中國）有限公司]。

2 方法

2.1 ?模型的建立

40只SPF級ICR乳鼠實驗性飼養1周后，隨機選取10只設為正常對照組，其余30只小鼠進行造模，采用經口灌服（自然吸允法）法，用微量加樣器將猴RV SA11株懸液50 μL/d經乳鼠口灌服，1次/d，連續2 d[9]。分別單籠飼養，第3天收集造模組小鼠糞便，用無菌棉拭子采集糞便于無菌試管中，用RV抗原快速檢測試劑檢測，結果呈陽性表明RV腹瀉模型造模成功。

2.2 ?分組及給藥

模型建立后按隨機數字表法分為模型組、加味椒艾丸組、丁桂貼組3組，每組10只。正常對照組與模型組分別用淀粉調糊敷貼神闕穴，藥物干預組分別用加味椒艾丸、丁桂兒臍貼敷貼神闕穴，1次/d，敷貼時間12 h，連續5 d。

2.3 ?穴位定位

參照“十五”國家規范統編教材《實驗針灸學》實驗動物鼠標準穴位圖譜定位及擬人對照點法定位[10]。神闕穴：根據類比原理，按人體該穴的體表穴位法，取小鼠胸腹正中，胸骨柄上緣至外生殖器連線上3/4與下1/4交界點。

2.4 ?觀察指標

2.4.1 ?糞便觀察 ?基于糞便的顏色、形態對糞便進行評分[11-12]，1分：正常大便;2分：淡黃色軟便;3分：淡黃色稀便;4分：水樣便。分值≥2分為腹瀉，無法獲得糞便的乳鼠視為無腹瀉。

2.4.2 ?ELISA檢測血清中TNF-α、IL-1β、Caspase-1含量 ?末次給藥后，禁食禁飲12 h，腹腔注射苯巴比妥鈉麻醉，以摘眼球取血法收集血樣，ELISA檢測各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、Caspase-1的水平。具體檢測方法參照試劑盒提供的流程標準操作。

2.4.3 ?Western blot檢測腸組織中p65、NF-κB蛋白表達 ?將胃幽門下端到盲腸前端的腸組織沖洗，取1/3腸組織用PBS緩沖液漂洗2～3次，勻漿后加入蛋白提取試劑。刮下細胞使其充分裂解，30 min后收集上清液，取一部分使用BCA法測定蛋白濃度。剩余部分變性后于-20 ℃保存，按照說明書配制10%的丙烯酰胺凝膠，電泳30 min、轉膜150 min，封閉1 h，一抗稀釋液4 ℃搖床過夜，用TBST洗3次，二抗室溫孵育30 min，用TBST在室溫下搖床上洗4次后顯影成像。

2.4.4 ?HE染色觀察腸組織病理改變 ?對剩余的2/3結腸與回腸組織進行脫水、浸蠟，并且包埋、切片后，再用HE染色對切片進行染色，鏡下觀察組織病理形態變化。

2.5 ?統計學分析

使用SPSS 21.0統計學軟件整理數據，計量資料用“x±s”表示，數據滿足正態性及方差齊性者用多因素方差分析，兩兩比較用LDS檢驗，若不滿足方差齊性用Dunnett T3檢驗。否則用非參數檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 ?各組小鼠糞便評分比較

與正常對照組比較，模型組小鼠糞便評分明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，丁桂貼組及加味椒艾丸組評分明顯下降（P<0.05）;丁桂貼組與加味椒艾丸組評分比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1。

3.2 ?各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、Caspase-1含量比較

各組小鼠IL-1β組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。與正常對照組比較，模型組小鼠TNF-α、Caspase-1表達明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）;與模型組比較，丁桂貼組與加味椒艾丸組TNF-α、Caspase-1表達明顯下調，差異有統計學意義（P<0.01，P<0.05）;與加味椒艾丸組比較，丁桂貼組Caspase-1含量明顯降低，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖2。

3.3 ?各組小鼠小腸p65、NF-κB蛋白表達比較

與正常對照組比較，模型組p65、NF-κB蛋白表達顯著上調，差異有統計學意義（P<0.01）;與模型組比較，丁桂貼組與加味椒艾丸組p65、NF-κB蛋白表達明顯下調，差異有統計學意義（P<0.01）;與丁桂貼組比較，加味椒艾丸組p65、NF-κB差異無統計學意義（P>0.05）。見圖3。

3.4 ?各組小鼠腸組織HE染色結果

正常對照組小鼠回腸和結腸黏膜上皮未見異常;模型組小鼠回腸和結腸黏膜上皮變性壞死，部分黏膜上皮缺失，且伴有不同程度的黏膜層血管擴張;丁桂貼組和加味椒艾丸組小鼠回腸和結腸黏膜上皮部分缺失，黏膜層血管少量擴張。見圖4。

4 討論

RV腹瀉屬于中醫學“泄瀉”范疇，其發病多與感受外邪，內傷脾胃有關。而小兒臟腑多嬌嫩，感受外邪易傷脾胃，導致泄瀉。神闕穴屬于任脈之穴位，《銅人腧穴針灸圖經》載錄神闕穴能“治泄利不止”，此亦RV腹瀉最為常見與最主要的臨床癥狀。現代解剖學證實，神闕穴[13]周圍血運豐富，具有豐富的靜脈網，且該處皮膚較薄，有利于藥物滲透吸收。前期研究[8]顯示，加味椒艾丸具有燥濕運脾、導滯清痢之功，運用該藥貼敷神闕穴有利于藥物直達病所，增強療效。

RV腹瀉與相關炎癥因子破壞腸上皮機械屏障有關，如TNF-α、IL-6炎癥因子啟動炎癥反應并形成級聯效應損傷腸黏膜導致腸內感染[14]。NF-κB信號通路誘導表達的靶基因主要有TNF-α、IL如IL-1、IL-6及IL-8等，而NF-κB信號通路介導的細胞凋亡主要與Caspase的激活有關[15]。在疾病的病理進程中，病毒感染后腸組織細胞在相關因子的作用下激活NF-κB 信號通路，腸上皮細胞中過度的炎癥小體激活足以導致腹瀉和病理改變[16]。RV腹瀉可能的病理機制與腸道炎癥反應和細胞凋亡有關，如RV感染性腹瀉患者在早期的血清檢測中IFN-γ、IL-6、TGF-β等炎癥因子水平較正常者升高[17-18]。在Caspase家族中，Caspase-1蛋白具有對IL前體的活化作用，參與細胞凋亡，同樣NOD蛋白活化NF-κB也會介導炎癥發生[19]。如NOD樣受體家族中含有吡啶結構域-3（NLRP3）的炎性小體通過Caspase-1的切割和隨后的IL-1β和IL-18的激活和分泌負責炎癥反應的激活[20]。在NOD1信號通路中，泛素化在信號級聯反應中發揮重要作用，可導致NF-κB的亞基p65、p50的核易位，NOD蛋白可介導激活NF-κB，通過NF-κB相關信號通路介導下游炎癥細胞因子的表達[21]。

本實驗研究表明，經口灌猴RV造模的小鼠血清TNF-α、Caspase-1含量明顯升高（P<0.01）;在腸組織蛋白表達檢測中，p65、NF-κB蛋白表達顯著升高（P<0.01），表明腸RV感染可導致NOD1/NF-κB信號通路激活，導致相關炎癥因子釋放入血，引起腸組織黏膜層血管擴張，并出現回腸和結腸黏膜上皮變性壞死等病理改變。經加味椒艾丸貼敷干預后，小鼠血清中TNF-α、Caspase-1含量明顯下降（P<0.05， P<0.01），p65、NF-κB蛋白表達明顯下調（P<0.05， P<0.01），提示加味椒艾丸敷貼神闕穴通過NOD1/NF-κB信號通路發揮抗炎作用，對治療RV感染性腹瀉小鼠的可能作用機制是抑制炎癥相關的TNF-α、Caspase-1因子及NF-κB蛋白的表達，起到緩解腸道炎癥作用，從而改善腹瀉癥狀及腸組織病理。然而NOD1/NF-κB信號通路尚有諸多分子，且加味椒艾丸敷貼神闕穴治療RV腹瀉對相關基因表達調控作用機制尚不明確，有待后續進一步的研究。

參考文獻

[1] 張 ?野.沈陽地區5歲以下兒童秋冬季輪狀病毒腹瀉的流行病學研究[J].航空航天醫學雜志，2021，32（2）：166-167.

[2] 忽欣怡，李 ?雲，李學堯，等.小兒感染性腹瀉病因研究進展[J].臨床軍醫雜志，2021，49（1）：114-116.

[3] 章瑀穎，龍 ?君，王祖蓉，等.急性腹瀉嬰幼兒輪狀病毒感染特征及相關危險因素分析[J].臨床消化病雜志，2020，32（4）：240-244.

[4] 楊應雄.輪狀病毒性腸炎腸外器官損傷的臨床研究[J].中國繼續醫學教育，2020，12（32）：138-140.

[5] 張 ?莎，王 ?文，李 ?哲，等.穴位敷貼治療腹瀉型腸易激綜合征的系統評價[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（9）：1002-1007.

[6] 李翠聯，馬 ?琛，曹 ?彬.葛根芩連丸治療成人急性感染性腹瀉的研究[J].湖南中醫藥大學學報，2013，33（4）：22-23.

[7] 劉百祥，余 ?闐，張 ?兵，等.椒艾丸穴位貼敷治療嬰幼兒輪狀病毒腹瀉57例[J].湖南中醫雜志，2015，31（3）：9-11.

[8] 劉百祥，曹 ?衍，楊曼瓊，等.加味椒艾丸辨證貼敷治療嬰幼兒急性腹瀉60例療效觀察[J].湖南中醫雜志，2016，32（11）：7-9.

[9] 楊蒙蒙，羅佳波，陳 ?文，等.人輪狀病毒感染昆明小鼠乳鼠模型的建立[J].中國比較醫學雜志，2009，19（3）：45-49，88-89.

[10] 余曙光，郭 ?義.實驗針灸學[M].上海：上海科學技術出版社，2009.

[11] BOSHUIZEN J A， REIMERINK J H， KORTELAND-VAN MALE A M， et al. Changes in small intestinal homeostasis， morphology， and gene expression during Rotavirus infection of infant mice[J]. Journal of Virology， 2003， 77（24）： 13005-13016.

[12] 宋麗軍，趙文昌，譚曉梅，等.Wa株輪狀病毒感染昆明小鼠乳鼠腹瀉模型的建立及影響因素考察[J].遼寧中醫藥大學學報，2013，15（4）：11-14.

[13] 姜勁峰，徐旺芳，俞興根，等.基于血管生物學的神闕穴特異性解析[J].中國針灸，2017，37（12）：1304-1308.

[14] 金佳寧，王 ?偉，王偉明.人感染輪狀病毒致病機制中西醫研究進展[J].遼寧中醫藥大學學報，2021，23（4）：98-101.

[15] 鄧冰湘，盧金冬.NF-κB信號通路在腦缺血再灌注損傷中的作用及中藥有效組（成）分的干預研究[J].湖南中醫藥大學學報，2014，34（7）：54-58.

[16] RAUCH I，DEETS K A， JI D X， et al. NAIP-NLRC4 inflammasomes coordinate intestinal epithelial cell expulsion with eicosanoid and IL-18 release via activation of caspase-1 and -8[J]. Immunity， 2017， 46（4）： 649-659.

[17] 張付麗，李 ?燕，周海瀾，等.輪狀病毒感染性腹瀉患者感染早期血清中IL-6、IFN-γ、TGF-β水平的檢驗價值[J].國際醫藥衛生導報，2020，26（16）：2441-2443.

[18] 周曉鳳，曹志群，王曉妍，等.輪狀病毒與TLRs的關系及其中醫藥研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2019，25（17）：202-208.

[19] 鄭 ?媛，安 ?麗，仇 ?杰，等.NOD1和NOD2介導的信號通路研究進展[J].中國醫藥科學，2015，5（23）：49-52.

[20] NAKATA A， NADATANI Y， WATANABE T， et al. NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3 inflammasome activation exacerbates 5-fluorouracil-induced small intestinal mucositis via interleukin-1β activation[J]. Digestion， 2021， 102（2）： 298-312.

[21] ELIA P P， TOLENTINO Y F， BERNARDAZZI C， et al. The role of innate immunity receptors in the pathogenesis of inflammatory bowel disease[J]. Mediators of Inflammation， 2015， 2015： 936193.