水生軟體動物中氯霉素的測定

陳 磊

（馬鞍山市市場監(jiān)管綜合行政執(zhí)法支隊，安徽馬鞍山 243000）

氯霉素是一種廣譜抗菌藥物，由Ehrlichz在1947年首次分離得到[1]。氯霉素不僅對多數(shù)革蘭氏陽（陰）性菌有很好的抑制作用，而且對沙門氏菌病和大腸桿菌病有很好的治療作用，因此在疾病的預(yù)防和治療方面得到了廣泛的應(yīng)用[2-3]。但隨著廣泛應(yīng)用后發(fā)現(xiàn)，氯霉素可導(dǎo)致人類再生障礙性貧血、粒細胞缺乏病、灰嬰綜合癥、溶血性貧血等，具有毒副作用[4-5]。當前許多國家在食品生產(chǎn)環(huán)節(jié)都禁止使用氯霉素，我國農(nóng)業(yè)部于2019年頒布第250號公告《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留量》中規(guī)定氯霉素在動物源性食品中不得檢出[6-7]。目前現(xiàn)行有效的氯霉素檢測標準中樣品處理的步驟煩瑣，試劑耗材使用量大，因此本文提出一種高效、準確、環(huán)保的方法來檢測氯霉素。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 實驗儀器

AB 3500型液相色譜配備三重四級桿質(zhì)譜儀（美國，SCIEX）；ME204/02型萬分之一天平（瑞士，梅特勒-托利多）；Arium-Pro型純水系統(tǒng)（德國，賽多利斯）；S-700B型多參數(shù)測試儀（瑞士，梅特勒-托利多）；T18型分散機（德國，IKA）；0.22 μmPTFE微孔濾膜（德國，CNW）；HC-3018型離心機（中國，中科中佳）；HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL）（美國，waters）；24位固相萃取裝置（德國，CNW）；N-EVAP 5085型氮吹儀（美國，Organomation Associates）。

1.1.2 實驗試劑

氯霉素、D5-氯霉素均由德國Dr.Ehrenstorfer公司提供；乙腈（LC-MS級，默克）；甲酸（LC-MS級，TCI）；甲醇（LC-MS級，默克）；乙酸乙酯（色譜純，TEDIA）；氨水（優(yōu)級純，國藥）；檸檬酸（分析純，阿拉丁）；磷酸氫二鈉（分析純，阿拉丁）；氫氧化鈉（分析純，國藥）；乙二胺四乙酸二鈉（分析純，國藥）；實驗室用水均為超純水。

1.1.3 試劑配制

①Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液。稱取檸檬酸12.9 g，磷酸氫二鈉10.9 g，乙二胺四乙酸二鈉37.2 g，加水900 mL溶解，用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至4.0±0.5，加水定容至 1 000 mL。②氯霉素標準儲備液（100 μg/mL）。準確稱取0.01 g 的氯霉素標準物質(zhì)，用乙腈配制成 100 μg/mL標準儲備液。③氯霉素標準中間液（10 μg/mL）：移取1 mL 的氯霉素標準儲備液，用乙腈配制成10 μg/mL標準儲備液。④D5-氯霉素標準儲備液（100 μg/mL）。準確稱取0.01 g 的D5-氯霉素標準物質(zhì)，用乙腈配制成100 μg/mL標準儲備液。 ⑤D5-氯霉素標準中間液（1 μg/mL）。移取1 mL 的D5-氯霉素標準儲備液，用乙腈配制成1 μg/mL標準儲備液。 ⑥D(zhuǎn)5-氯霉素標準工作液（0.1 μg/mL）。移取1 mL 的D5-氯霉素標準中間液，用乙腈配制成0.1 μg/mL標準儲備液。⑦氯霉素標準工作液。分別移取0.01 ml、0.05 mL、0.10 mL、0.50 mL、 1.00 mL 的氯霉素中間液和1 mLD5-氯霉素標準工作液至 10 mL容量瓶中，并用初始流動相定容至刻度配制濃度為 0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL和10.0 ng/mL，的工作液，混勻。

1.2 色譜條件與質(zhì)譜條件

1.2.1 色譜條件

月旭Ultimate C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：2 μL；流動相：10 mmol/L乙酸銨水溶液（A）和乙腈（B）；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源（ESI）；負離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子源溫度（TEM）：550 ℃；電噴霧電壓：-4 500 V；氣簾氣：35 psi；噴霧氣（GS1）：55 psi；輔助加熱氣（GS2）：55 psi；其他質(zhì)譜條件見表2。

表2 氯霉素質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化條件

1.3 實驗方法

稱取2.0 （g精確至0.1 mg）置于50 mL離心管中加入100 μL， 20 mLNa2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液，10 000 r/min勻漿提取1 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液以2 mL/min的速度過HLB固相萃取柱（使用前分別用6 mL甲醇和6 mL水活化），待試樣完全流出后，依次用8 mL水和5 mL甲醇水溶液（甲醇∶水體積比為1∶19）淋洗，棄去全部流出液，抽干，用8 mL甲醇洗脫，在40 ℃水浴下氮氣吹至近干，用2 mL初始流動相復(fù)溶，過0.22 μmPTFE濾膜，待上機測試。氯霉素測試結(jié)果見圖1。

圖1 氯霉素標準MRM色譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液的選擇

本文分別選用乙腈-Mcllvaine、堿化乙酸乙酯以及Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液作為提取液，對氯霉素進行提取。發(fā)現(xiàn)這3種提取液對氯霉素的提取效率沒有明顯差異，為減少有機試劑的使用量，本文最終選擇了Na2EDTAMcllvaine緩沖溶液為提取液。

2.2 固相萃取柱的選擇

HLB固相萃取柱中的填料是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，其對非極性至中等極性的酸性、中性、堿性目標化合物均有高而穩(wěn)定的回收率。即使柱床干涸，回收率也不受影響。相同規(guī)格下HLB固相萃取柱的柱容量是傳統(tǒng)C18固相萃取柱的3倍。因此選用HLB固相萃取柱進行樣品 分析。

2.3 工作曲線和檢出限

按照實驗方法，對濃度分別為0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL和10.0 ng/mL標準系列溶液進行測定，以氯霉素的質(zhì)量濃度為橫坐標，與其對應(yīng)的峰面積為縱坐標繪制工作曲線。結(jié)果表明，氯霉素的質(zhì)量濃度與其對應(yīng)的峰面積之間呈線性關(guān)系。線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表3。將混標添加在空白基質(zhì)樣品中，在相同條件下進行6次平行試驗，按照3倍信噪比考察了氯霉素的檢出限（見表3）。

表3 線性參數(shù)和檢出限

2.4 加標回收試驗

分別稱取4種水生軟體動物陰性樣品2.0 g（精確至 0.1 mg），按照實驗方法對其進行不同濃度水平的加標回收試驗，每個濃度平行進行6次實驗，計算回收率，結(jié)果見表4。

表4 回收試驗結(jié)果(n=6）

3 結(jié)論

本文建立了Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液為提取液，連用HLB固相萃取柱凈化的方法對市售水生軟體動物進行前處理，使用液相色譜聯(lián)用三重四級桿質(zhì)譜儀測定氯霉素。該方法操作簡便、準確度高，經(jīng)濟適用型好，分離度符合要求，適合軟體動物中氯霉素的定性和定量分析，為水生軟體動物的市場監(jiān)管提供了有力的技術(shù)支持。