穩定表達熒光素酶BGC823細胞系的構建

王 琳， 張紫怡， 金 靜， 段海瀟， 王潤楊， 胡 翰， 汪 洋， 劉濱磊

(湖北工業大學生物工程與食品學院， 湖北 武漢 430068)

圖 1 BGC823細胞對不同濃度嘌呤霉素敏感性曲線

圖 2 流式細胞儀檢測BGC823-Fluc單克隆細胞純度

圖 3 BGC823細胞與FLuc-BGC823細胞生長對比

圖 4 相對熒光值與細胞數目的相關性曲線

圖 5 活體動物拍攝裸鼠腹腔植瘤

胃癌的形態學、分子特征復雜，具有高度異質性，為了鑒定病理和分子生化機制，已經在大鼠和小鼠中建立了各種實驗動物模型[1]。生物發光是存在于生物體內的一種特殊類型的發光現象，主要指在酶的催化作用下將生物能轉化成光能的過程，而不依賴于有機體對光的吸收[2]。生物發光成像技術具有非侵襲性、可定量、高靈敏度、操作簡單，以及能夠實時及連續動態監測等優點，被廣泛應用于生物醫學研究等領域[3]。

熒光素酶(luciferase)報告系統是生物發光最常見的系統之一，是luciferase 以熒光素(luciferin)、三磷酸腺苷(ATP)和O2為底物，在Mg2+存在時發生酶促反應產生光子的過程[4]。熒光素酶報告基因被廣泛應用于構建特殊的單克隆細胞系，用于抗腫瘤藥物的篩選。被熒光素酶標記的腫瘤細胞可通過腹腔植瘤到動物體內，可用生物發光成像儀進行檢測。柯宗煌等人構建了穩定表達熒光素酶的B16R細胞系，并構建適用于小動物活體成像觀察的C57 小鼠皮下移植瘤模型[5]。

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是重要的探針分子，廣泛應用于標記特定分子或細胞[6]，其缺陷是不能像酶一樣有信號放大作用[7]，表達量低時不易檢測。熒光素酶標記的細胞檢測時需添加熒光素酶底物，可快速、無創地進行活體檢測，具有較高的靈敏性、特異性和組織穿透能力，適用于體內成像[8]。熒光蛋白作為一種自發熒光，受到激發光源后可在倒置顯微鏡下觀察到，因為自發熒光的體內成像可能被生物體內部一些組織干擾，比較適用體外的相關研究。本研究構建含單色熒光素酶以及GFP綠色熒光蛋白的BGC823細胞系，形成雙熒光標記，生物發光和熒光成像的優點被應用在一起，在實際應用中有更多兼容性。

1 材料與方法

1.1 細胞試劑和儀器

實驗使用的細胞株(BGC823)購于北京協和醫院細胞資源中心；細胞所用的培養基是DME/F-12(HyClone， USA)；lipofectamine 3000 轉染試劑盒購于Thermo Fisher Scientific 公司；PiggyBac-Dual-Promoter-Firefly Luciferase( PBDP-FLUC) 重組質粒和PBDP 轉座酶， 本實驗室提供。 大腸桿菌菌株DH5α，本團隊制備；質粒DNA小量抽提試劑盒(天根生物公司)。嘌呤霉素和MTS購自碧云天生物；BD流式細胞檢測儀，倒置熒光顯微鏡，Nikon公司)。多功能酶標儀Thermo Fisher Scientific；熒光素酶底物(翊圣)；北京東聯生物安全柜。

1.2 質粒的提取

從-80℃超低溫冰箱中取出用甘油保存的PBDP-FLuc質粒大腸桿菌。該質粒由實驗室前期構建并保存，在室溫快速解凍后以1∶1000的比例與LB液體培養基混勻，放37°C搖床1600 r/min進行搖菌15 h。質粒提取按照天根小提質粒試劑盒說明書操作。

1.3 細胞培養和轉染

BGC823細胞復蘇后培養在含10%胎牛血清的DME/F12培養基。轉染前一天，胰酶消化并將BGC823細胞并傳代至24孔板105個細胞每孔，細胞存活率97%。當細胞密度達到80%左右時，質粒PBDP-FLuc和PBDP-transposase以5∶1比例根據Lip3000說明書進行轉染操作。 BGC823細胞轉染24 h后在倒置顯微鏡的藍光和白光下可觀察到GFP陽性率。

1.4 細胞敏感性實驗及單克隆篩選

將細胞擴培到T 25瓶后，鋪24孔板。當24孔板中細胞覆蓋率達到80%時，棄去原細胞培養液。分別配置含嘌呤霉素濃度為1 、2 、 3、4、5、6、 7、 8、 9、10 μg/mL的DME/F12完全培養基，各3mL；給24孔板做好嘌呤霉素濃度標記，分別將含嘌呤霉素的DME/F12培養基加入對應孔，每種嘌呤霉素濃度設置3個孔平行對照。將24孔板轉移至CO2細胞培養箱中，溫度設置為37℃，CO2濃度設置為5%進行細胞培養，連續觀察細胞狀態，2 d更換一次培養基，最終以第4天殺死24孔板中所有細胞的最低嘌呤霉素濃度為最佳嘌呤霉素篩選濃度。

有限稀釋法獲得BGC823單克隆，用DME/F12完全培養基(含10% FBS)將細胞稀釋至1000個/mL。取干凈無菌96孔板，每孔中加入100 μL DME/F12完全培養基(含10%FBS)，再加入稀釋后的細胞懸液1 μL，于 CO2細胞培養箱中，37℃恒溫，5% CO2濃度進行細胞培養。待細胞貼壁后(7 d左右)，在倒置顯微鏡下觀察，記錄只有單個細胞增殖成團的孔。繼續在CO2細胞培養箱中，37℃恒溫，5% CO2濃度進行細胞培養。待細胞長至80%，在倒置熒光顯微鏡下檢測細胞發光情況，觀察到一個孔全部細胞均發光后， 進行擴大培養，依次擴大到24孔板、6孔板，再到T-25 cm2細胞培養瓶中進行培養，細胞長滿T-25 cm2細胞培養瓶。每個細胞樣品取106個用于后續流式檢測。

1.5 流式細胞儀檢測BGC823-FLuc細胞純度

用流式細胞儀對BGC823-FLuc單克隆細胞系進行純度鑒定。分別收集BGC823細胞和BGC823-FLuc細胞各106個于EP管中，將細胞懸液離心(800 r/min×4 min)，棄去舊培養液，加入1 mL PBS洗滌，離心(800 r/min× 4min)，加500 μL PBS重懸，將上樣密度調整為2×106個/mL，過細胞濾網，流式細胞儀設置上樣細胞數為5×105個，檢測細胞純度，純度大于98%即為單克隆穩轉細胞系。

1.6 MTS實驗檢測細胞活力與生長曲線

取5塊干凈無菌96孔板，將培養的BGC823細胞和BGC823-FLuc細胞消化計數后，接種到同一塊96孔板中(共3個平行孔)，每孔加100 μL密度為5×105個/mL的細胞懸液，CO2細胞培養箱中，37℃恒溫，5% CO2濃度進行細胞培養。5塊96孔板的培養時間分別為0、24、48、72、96 h。

培養結束后參照MTS說明書進行如下操作：加入MTS 20 μL，CO2細胞培養箱中繼續孵育4 h后，置于多功能酶標儀上，在490 nm波長處，以培養基所在孔測定的吸光度值作為背景值，計算時所有樣品測定的吸光度值均減去背景值。生長曲線的縱坐標是吸光度值，橫坐標是BGC823細胞數目，Excel繪制細胞生長曲線。

1.7 熒光素酶活性鑒定

細胞傳代培養后，收集細胞，梯度稀釋后加入到96孔板中，每孔100 uL，BGC823-FLuc細胞數分別為5×104、2.5×104、1.25×104、6250、3125、1563個，每種密度設置4個平行孔。設置對照孔，加入100 uL PBS 緩沖液，設置4個平行孔。按照熒光素酶底物使用說明書，全程避光，各孔均加入稀釋50倍的熒光素酶底物100 uL，使熒光素酶底物濃度為0.15 mg/mL，培養箱孵育5 min，多功能酶標儀檢測化學發光。

1.8 BGC823細胞和BGC823-FLuc細胞的裸鼠體內成瘤實驗

隨機選取5～6周齡裸鼠9只，分成3組，每組3只。對第一組裸鼠均腹腔注射100 μL，密度為5×106個/mL的BGC823-FLuc細胞；對第二組裸鼠均腹腔注射100 μL，密度為5×106個/mL的BGC823細胞；對第三組裸鼠腹腔注射100 μL PBS緩沖液。接種7 d后，按照熒光素酶底物使用說明書，腹腔注射熒光素酶反應底物，底物用量30 mg/mL，100 μL/只，讓裸鼠自由活動10 min后，麻醉裸鼠，再進行動物活體成像，拍攝記錄三組裸鼠體內熒光素酶發光情況。

2 結果

2.1 BGC823細胞對嘌呤霉素敏感性實驗

通過查閱文獻，選取嘌呤霉素的濃度范圍為1～10 μg/mL進行細胞敏感性實驗。通過最終繪制曲線可知，4天內殺死所有細胞的最低嘌呤霉素濃度為6 μg/mL。因此6 μg/mL作為嘌呤霉素加壓篩選的最佳濃度。

2.2 流式細胞儀檢測BGC823-FLuc細胞純度

對穩轉BGC823-FLuc細胞與BGC823細胞進行流式細胞儀鑒定。通過對比兩者流式檢測結果可知，FL1-A+表示GFP陽性率，與對照組相比GFP陽性率為99.9%，說明BGC823-Fluc單克隆細胞系構建成功。

2.3 MTS實驗測定BGC823細胞與BGC823-FLuc細胞生長曲線

MTS法檢測BGC823細胞活力值。OD 490顯示，與對照組相比，轉染了熒光素酶基因的細胞在0、24、48、72、96這幾個時間點吸光度值差異無顯著性(P>0.05)，說明穩轉熒光素酶基因對BGC823細胞增殖幾乎無影響。

2.4 熒光素酶檢測

以細胞數目為橫坐標，相對熒光值為縱坐標，繪制細胞數目與相對熒光值的相關性曲線，相對熒光值和BGC823-Fluc細胞數目成正比例關系，且細胞數目和相對熒光值相關性為0.9791，說明熒光素酶在單克隆細胞系中表達。

2.5 BGC823-FLuc和BGC823裸鼠腹腔植瘤結果

裸鼠腹腔進行BGC823-Fluc和BGC823細胞注射后，7 d后腹腔注射熒光素酶反應底物30 mg/mL，100 μL/只，讓裸鼠自由活動10 min后，在動物活體成像系統中檢測裸鼠體內發光情況。第一組3只裸鼠體內注射BGC823-Fluc，活體動物成像顯示，3只老鼠體內均能檢測到熒光，可以通過熒光來判斷裸鼠體內腫瘤進展。第二組3只裸鼠體內注射BGC823，未檢測到熒光。第三組3只裸鼠體內注射PBS，也未檢測到明顯熒光。

3 討論與結論

通過脂質體轉染的方法，將含GFP和熒光素酶的重組質粒轉染到胃癌細胞(BGC823)中，經過嘌呤霉素加壓篩選，有限稀釋法挑選單克隆，經擴大培養后，MTS實驗進行細胞活力鑒定并繪制生長曲線，流式細胞儀鑒定，陽性率為99.9%，表明成功構建表達GFP及熒光素酶基因(FLuc)的胃癌細胞系(BGC823-FLuc)。葛曉梅等構建的人胃癌細胞系顯示PDX模型來源的腫瘤細胞系不能完全替代PDX模型，需要和PDX模型結合使用[9]，在單個細胞系中結合不同的生物讀數提供了優于常規基于細胞的測定的顯著優勢，并接種到裸鼠皮下，建立裸鼠胃癌細胞模型，結合動物活體成像技術監測腫瘤的生長過程。

這一模型的成功構建，能夠為胃癌治療藥物篩選、胃癌免疫學治療、腫瘤的聯合治療手段等動物水平實驗提供極的大便利，能夠讓觀察者直觀而精確地判斷腫瘤在體內的進展。與綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白等報告基因相比，熒光素酶靈敏度更高，穩定性更好，背景干擾更低，在動物體內的穿透性更強[10-13]，使熒光素酶報告基因在腫瘤治療和其他生物學領域發揮更大作用。