胃癌組織Rap1GAP、HHLA2表達變化及其與患者臨床病理特征和預后的關系

王東琴，張欣，霍浩然，秦瑞峰，袁增江

邯鄲市中心醫院普外科，河北邯鄲056000

胃癌是全球范圍內常見的惡性腫瘤之一，每年新發病例約99萬例、死亡病例約73萬例［1］。我國是胃癌的高發國家之一，據統計，我國每年胃癌新發病例占全球的一半左右［2］，并且許多患者就診時已屬進展期，預后較差，5年生存率較低。胃癌的發病機制非常復雜，涉及多種原癌基因和（或）抑癌基因突變、生長因子及其受體異常表達等，但其確切的發病機制仍不十分清楚。Rap1 GTP酶激活蛋白（Rap1-GAP）是GTP酶激活蛋白家族中的一員，能夠通過負性調控Rap1活性抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移等［3］。有研究報道，Rap1GAP在乳腺癌、胰腺癌、膠質瘤等組織中表達下調，其表達下調能夠促進腫瘤細胞的增殖和侵襲［3-5］。人內源性逆轉錄病毒-H長末端重復關聯蛋白2（HHLA2）是新發現的B7家族成員，具有免疫監視、輔助T細胞激活、維持免疫環境穩定等作用。有研究發現，HHLA2在多種惡性腫瘤組織中高表達，其高表達能夠促進腫瘤免疫逃逸，從而導致腫瘤侵襲和轉移［6-7］。但目前Rap1GAP、HHLA2表達與胃癌發生、發展的關系尚不清楚。2015年8月—2017年9月，本研究觀察了胃癌組織Rap1GAP、HHLA2 mRNA表達變化，并探討其表達與患者臨床病理特征和預后的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 同期選擇邯鄲市中心醫院收治的胃癌患者97例。所有患者符合胃癌臨床診斷標準，并經術后組織病理檢查明確診斷。納入標準：①符合胃癌診斷標準；②具有胃癌根治性手術適應證，自愿接受胃癌根治術；③初診，術前未接受任何抗腫瘤治療；④臨床病理資料和術后隨訪資料完整。排除標準：①伴有胃肉芽腫、胃結核、胃狹窄等其他胃部疾病者；②既往有胃部手術史者；③合并其他部位惡性腫瘤者；④合并心、肝、腎等重要臟器嚴重功能不全者。其中，男52例、女45例，年齡51～73（58.79±5.62）歲，腫瘤直徑2～6（3.42±0.39）cm；組織分化程度：高分化42例，低中分化55例；浸潤深度：T1、2期39例，T3、4期58例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期38例，Ⅲ、Ⅳ期59例；有淋巴結轉移29例，無淋巴結轉移68例。本研究經邯鄲市中心醫院醫學倫理委員會批準（審批編號：H20201012006），患者或其家屬知情同意并簽屬知情同意書。

1.2 Rap1GAP、HHLA2 mRNA表達檢測 采用RTqPCR法。取胃癌組織及其配對的癌旁組織（距腫瘤組織邊緣5 cm以上，并經組織病理檢查證實為正常胃組織）各約100 mg，勻漿器中充分研磨，離心后棄上清液。剩余沉淀采用TRIzol法提取總RNA，經紫外可見分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0。按M-MLV逆轉錄酶說明將總RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄條件：50℃45 min，85℃5 min。以cDNA為模板，按熒光定量PCR擴增檢測試劑盒說明進行PCR擴增。所有引物由賽默飛世爾科技（中國）有限公司設計合成。引物序列：Rap1GAP上游引物5′-GCACTTTCTCGGCAAGGAGCATTT-3′，下 游 引 物5′-TGACATCATGGTATGTCCGGCACT-3′；HHLA2上游引物5′-TACAAAGGCAGTGACCATTTGG-3′，下游引物5′-AGGTGTAAATTCCTTCGTCCAGA-3′；GAPDH上 游 引 物5′-TGACGTGCCGCCTGGAGA?AAC-3′，下游引物5′-CCGGGCATCGAAGGTG?GAAGAG-3′。PCR反應體系共25μL：cDNA模板2μL，2 mmol/L MgCl22μL，2.5 mmol/L dNTP 1.6μL，1 mmol/L上下游引物各0.6μL，800 U/L EX TaqHS DNA聚合酶1μL，1×PCR緩沖液17.2μL；反應條件：95℃2 min，95℃30 s、52℃30 s、72℃45 s共35個循環，最后72℃10 min。擴增反應結束后進行熔解曲線分析，以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算Rap1GAP、HHLA2 mRNA相對表達量。所有操作于CFX96實時熒光定量PCR儀上完成。

1.3 隨訪 所有患者出院后采用門診復查或電話形式定期隨訪，每3個月隨訪1次。隨訪截至2020年9月30日。統計隨訪期間患者因腫瘤死亡情況，計算5年生存率。

1.4 統計學方法 采用SPSS25.0統計軟件。計量資料經K-S檢驗符合正態分布，以±s表示，結果比較采用獨立樣本t檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率比較采用Log-Rank檢驗。危險因素分析采用Cox風險比例回歸模型。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織與癌旁正常組織Rap1GAP、HHLA2 mRNA表達比較 胃癌組織Rap1GAP、HHLA2 mRNA相對表達量分別為0.32±0.08、1.03±0.21，癌旁正常組織分別為0.86±0.21、0.42±0.09。胃癌組織Rap1GAP mRNA相對表達量低于癌旁正常組織，HHLA2 mRNA相對表達量高于癌旁正常組織（t分別為22.866、18.612，P均<0.05）。

2.2 胃癌組織Rap1GAP、HHLA2 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系 見表1。

2.3 Rap1GAP、HHLA2 mRNA表達與胃癌患者預后的關系 97例胃癌患者全部獲得隨訪，隨訪截至2020年9月30日，死亡43例，無失訪病例。以Rap1GAP mRNA相對表達量的中位數（0.30）為截斷值，將患者分為Rap1GAP mRNA高表達者（≥0.30，46例）與低表達者（<0.30，51例）；以HHLA2 mRNA相對表達量的中位數（1.01）為截斷值，將患者分為HHLA2 mRNA高表達者（≥1.01，50例）與低表達者（<1.01，47例）。Rap1GAP mRNA低表達者5年生存率為37.25%（19/51），Rap1-GAP mRNA高 表 達 者 為76.09%（35/46）；HHLA2 mRNA高表達者5年生存率為44.00%（22/50），HHLA2 mRNA低 表 達 者 為68.09%（32/47）。Rap1GAP mRNA低表達者5年生存率低于Rap1GAP mRNA高表達者，HHLA2 mRNA高表達者5年生存率低于HHLA2 mRNA低表達者（χ2分別為13.831、6.098，P均<0.05）。

2.4 胃癌患者預后不良的危險因素分析 以隨訪截至日期胃癌患者生存情況為因變量（存活=0，死亡=1），以性別（男=1，女=2）、年齡（連續變量）、腫瘤直徑（≥3 cm=1，<3 cm=2）、TNM分期（Ⅰ、Ⅱ期=1，Ⅲ、Ⅳ期=2）、浸潤深度（T1、2期=1，T3、4期=2）、組織分化程度（低中分化=1，高分化=2）、淋巴結轉移（是=1，否=2）、Rap1GAP mRNA表達（連續變量）、HHLA2 mRNA表達（連續變量）為自變量，納入Cox風險比例回歸模型。單因素Cox風險比例回歸分析顯示，TNM分期、組織分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、Rap1GAP mRNA表達、HHLA2 mRNA表達可能與胃癌患者預后不良有關（P均<0.05）；多因素Cox風險比例回歸分析顯示，有淋巴結轉移、Rap1-GAP mRNA低表達、HHLA2 mRNA高表達是胃癌患者預后不良的危險因素（P均<0.05）。見表2。

表2 胃癌患者預后不良的Cox風險比例回歸分析結果

3 討論

胃癌是我國乃至全球常見的消化系統惡性腫瘤之一，其病因和發病機制非常復雜，如幽門螺旋桿菌感染、細胞周期相關蛋白異常表達、上皮間質轉化、腫瘤免疫逃逸、原癌基因激活和抑癌基因失活等［8-9］，但其確切的發病機制仍不十分清楚。因此，深入探索與胃癌發生、發展相關的分子機制，對尋找有效的分子診斷標志物和治療靶點具有重要意義。

Rap1GAP是GTP酶激活蛋白家族中的一員，能夠負性調控Rap1活性。Rap1屬于小分子G蛋白Ras超家族成員之一，具有逆轉原癌基因Ras激活突變體引起的細胞形態改變和傳遞致癌信號兩種截然不同的作用，其活性增強可促進腫瘤細胞侵襲和遷移［10］。Rap1GAP編碼的蛋白酶可將Rap1與GTP結合的活化形式催化轉變為Rap1與GDP結合的失活形式，從而影響真核細胞的增殖、黏附和遷移等生物學行為［11］。在惡性腫瘤組織中，Rap1GAP mRNA扮演抑癌基因角色。SHAH等［3］研究報道，Rap1GAP表達下調可促使乳腺導管原位癌細胞的細胞外信號調節激酶/有絲分裂原活化蛋白激酶激活，誘導廣泛的細胞骨架重組和間充質表型轉換，從而增強腫瘤細胞的侵襲性。GAO等［12］研究發現，結直腸癌組織Rap1GAP表達下調，并且其表達下調與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移和患者預后不良有關。但目前Rap1GAP在胃癌發生、發展中的作用尚不十分清楚。本研究結果發現，胃癌組織Rap1GAP mRNA相對表達量明顯低于癌旁正常組織，并且其低表達與腫瘤浸潤深度、TNM分期和淋巴結轉移有關，提示Rap1GAP mRNA低表達可增強胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，從而導致病情進展和患者預后不良，與高衛利等［13］報道一致。

表1胃癌組織Rap1GAP、HHLA2 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系

B7家族是一組具有免疫球蛋白結構特征的糖蛋白，其胞外域與IgV、IgC結構域具有同源性。共刺激信號是T細胞抗原特異性激活所必需的，當共刺激信號缺乏時，T細胞在識別抗原后不能有效增殖，無法產生免疫應答，而B7家族成員則成為共刺激信號的主要來源［14］。HHLA2是新發現的B7家族成員，作為T細胞負性共刺激分子，主要表達于人抗原呈遞細胞和T細胞，亦可表達于樹突狀細胞、巨噬細胞及B細胞，可為效應T細胞對腫瘤反應提供免疫監視，還能為記憶T細胞激活提供良好的免疫環境［15］。HHLA2在人體正常組織中極少表達，而在肺、卵巢、肝、食道等惡性腫瘤組織中高表達。JING等［6］研究報道，HHLA2在肝內膽管癌組織中表達明顯升高，并且其表達與腫瘤浸潤淋巴細胞水平密切相關。CHENG等［16］研究發現，HHLA2在非小細胞肺癌組織中廣泛表達，并與肺腺癌EGFR突變和腫瘤浸潤淋巴細胞增加有關。但HHLA2在胃癌發生、發展中的作用尚不十分清楚。本研究結果發現，胃癌組織HHLA2 mRNA相對表達量明顯高于癌旁正常組織，并且其高表達與腫瘤浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移有關，提示HHLA2 mRNA能夠參與胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移，其機制可能與HHLA2 mRNA過表達能夠抑制T細胞增殖，誘導腫瘤細胞逃避T細胞的殺傷作用，從而導致腫瘤細胞逃避免疫監視有關［17-18］。

本研究結果還發現，Rap1GAP mRNA低表達者5年生存率低于Rap1GAP mRNA高表達者，HHLA2 mRNA高表達者5年生存率低于HHLA2 mRNA低表達者；Cox風險比例回歸分析顯示，Rap1GAP mRNA低表達、HHLA2 mRNA高表達是胃癌患者預后不良的危險因素。結果提示，Rap1GAP、HHLA2 mRNA表達可作為胃癌預后評估的生物標志物。

綜上所述，胃癌組織Rap1GAP低表達、HHLA2高表達，二者異常表達與胃癌惡性生物學行為和患者預后不良有關。Rap1GAP、HHLA2 mRNA有可能成為胃癌預后評估的生物標志物和潛在的治療靶點。