LncRNA CCAT1對H2O2誘導的PC12細胞增殖、凋亡和氧化應激的影響及機制

董麗華 王曉艷 張文婧 李加梅 孫蕾

(日照市人民醫院神經內科，山東 日照 276800)

自由基增多、脂質過氧化、鈣穩態失調等可導致氧化應激增強，氧化應激時機體內產生大量活性氧(ROS)會導致細胞凋亡，氧化應激引起的神經細胞損傷是多種神經系統疾病發病的重要原因〔1，2〕。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類長度>200 nt不編碼蛋白的RNA分子，不僅參與了細胞增殖、氧化應激與自由基、細胞凋亡等，還參與了神經系統的生長發育、功能完善和神經系統損傷之后再生過程〔3，4〕。結腸癌相關轉錄因子(CCAT)1是最先在結腸癌中發現的一種LncRNA，定位于人染色體8q24.21上〔5〕，在多種惡性腫瘤中高表達，與腫瘤的發生、發展密切相關〔6〕。研究發現下調CCAT1表達可抑制結腸癌細胞增殖、遷移，并誘導凋亡〔7〕； CCAT1通過上調Livin抑制腎細胞癌細胞凋亡并增加細胞活力〔8〕。但CCAT1對氧化應激引起的神經損傷的影響及其機制還尚不清楚。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/信號轉導和轉錄激活因子(STAT)3信號通路是細胞生長和代謝過程中重要的信號通路，可調節細胞分化和凋亡，研究發現維生素B1通過激活該信號通路可保護谷氨酸誘導的神經細胞損傷〔9〕。烏司他丁通過激活Akt/mTOR信號通路減輕了大鼠心肌細胞氧化應激損傷〔10〕。但Akt/mTOR/STAT3信號通路對過氧化氫(H2O2)誘導的PC12細胞氧化損傷的影響還尚未清楚。研究發現H2O2可誘導PC12細胞氧化應激損傷〔11〕，因此，本研究用H2O2構建PC12細胞氧化應激損傷模型，通過檢測細胞活性及細胞凋亡率，測定丙二醛(MDA)含量變化和超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力。本文初步探討CCAT1在PC12細胞氧化應激損傷中作用，再進一步探討CCAT1調控Akt/mTOR/STAT3信號通路研究CCAT1的抗氧化機制。

1 材料和方法

1.1材料 PC12細胞購自中國科學院上海細胞庫；DMEM培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、過氧化氫、雷帕霉素(RAPA)購自美國Sigma公司噻唑藍(MTT)試劑盒、Trizol試劑、熒光定量試劑盒、LipofectamineTM2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；二辛可寧酸(BCA)試劑盒、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、異硫氰酸熒光素標記的膜聯素V/碘化丙啶(AV-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天公司；MDA試劑盒、SOD試劑盒、CAT試劑盒、GSH-Px試劑盒購自南京建成生物工程研究所；抗體購自北京博奧森生物科技有限公司；pcDNA-control、pcDNA-CCAT1載體由武漢維諾賽生物技術有限公司構建。Thermo FC酶標儀購自美國Thermo公司；FACS caliber流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 PC12細胞用含10%FBS的DMEM培養基，置于37℃，含5%CO2的恒溫箱中培養，每天換液1次，生長至80%時用0.25%的胰酶消化后傳代培養，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2細胞處理和分組 用濃度分別為0、100、200、400 μmol/L的H2O2處理PC12細胞24 h作為不同濃度處理組，以未經任何處理的細胞作為對照(control)組；將pcDNA-control、pcDNA-CCAT1質粒轉染至PC12細胞中后再用200 μmol/L的H2O2處理PC12細胞，記為H2O2+pcDNA-control組、 H2O2+pcDNA-CCAT1組；pcDNA-CCAT1質粒轉染至PC12細胞中后用200 μmol/L的H2O2處理PC12細胞后再用RAPA處理作為H2O2+pcDNA-CCAT1+RAPA組。具體轉染步驟按照LipofectamineTM2000試劑盒進行操作。

1.2.3MTT法測定細胞活力 各組細胞培養24 h后分別加入10 μl 5 mg/ml的MTT溶液，于37℃的恒溫培養箱中培養4 h；1 000 r/min離心10 min，吸棄培養液，每孔加150 μl的DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。然后在酶標儀上檢測490 nm波長的吸光度(A)值。細胞活性(%)=實驗組A值/空白對照組A值×100%。實驗重復3次，每次設3個復孔。

1.2.4實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測CCAT1表達水平 提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度。用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，按照熒光定量使用說明配制反應體系，CCAT1以β-actin為內參進行PCR擴增，每個樣品重復3次，循環條件為95℃ 10 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環；60℃延長5 min。相對表達量采用2-△△Ct法計算。CCAT1正向引物序列：5′-TTTATGCTTGAGCCTGA-3′，反向引物序列：5′-CTTGCCTGAAATACTTGC-3′；β-actin正向引物序列：5′-GGGAAATCGTGCGTACATTAA-3′，反向引物序列：5′-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3′。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 取各組細胞，胰蛋白酶消化后用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后重懸。按照AV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書，分別加入5 μl AV-FITC和10 μl PI，輕輕混勻后室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測激發波長488 nm和發射波長530 nm處的熒光強度，實驗重復3次。

1.2.6Western印跡檢測蛋白表達 提取細胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。測濃度后上樣，SDS-PAGE 90 min轉膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉90 min后加入一抗4℃孵育過夜；TBST洗膜后加入二抗室溫孵育2 h，再用TBST洗滌3次，每次5～10 min，顯影，定影，用Quantity One凝膠分析軟件處理，測各條帶吸光度值，蛋白相對表達水平=目的條帶吸光度值/β-actin條帶吸光度值。每個蛋白樣品設3個重復。

1.2.7MDA試劑盒、SOD試劑盒、CAT試劑盒、GSH-Px試劑盒分別檢測MDA含量和SOD、CAT、GSH-Px活力 收集各組細胞，去上清，PBS洗3遍，消化，吹打，然后800 r/min離心10 min，得細胞沉淀，再用PBS洗3遍，吹打均勻后超聲10 min使細胞裂解，40 r/min離心10 min取上清，用于MDA含量和SOD、CAT、GSH-Px活力的測定，具體操作按試劑盒說明書進行，實驗重復3次。

1.3統計學方法 采用SPSS20.00軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1不同H2O2濃度對PC12細胞活力及CCAT1表達的影響 與0 μmol/L H2O2組相比，不同H2O2濃度組PC12細胞活力及CCAT1表達水平均顯著降低(P<0.05)。見表1。可見，H2O2可降低PC12細胞活力和CCAT1表達水平。

表1 不同H2O2濃度對PC12細胞增殖及CCAT1表達的影響

2.2CCAT1過表達對H2O2誘導的PC12細胞增殖和凋亡的影響 與control組相比，H2O2組PC12細胞CCAT1表達水平顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，B細胞淋巴瘤(Bcl)-2表達水平顯著降低，Bcl-2相關x蛋白(Bax)表達水平顯著升高，細胞活力顯著降低(P<0.05)；與H2O2+pcDNA-control組相比，H2O2+pcDNA-CCAT1組PC12細胞CCAT1表達水平顯著升高，細胞凋亡率顯著降低，Bcl-2表達水平顯著升高，Bax表達水平顯著降低，細胞活力顯著升高(P<0.05)，見圖1，圖2，表2。可見，CCAT1過表達可抑制H2O2誘導的PC12細胞凋亡，促進細胞增殖。

表2 CCAT1過表達對H2O2誘導的PC12細胞增殖和凋亡的影響

圖1 CCAT1過表達對H2O2誘導的PC12細胞凋亡的影響

1～4：control組、H2O2組、H2O2+pcDNA-control組、H2O2+pcDNA-CCAT1組；下圖同圖2 CCAT1過表達對H2O2誘導的PC12細胞凋亡相關蛋白表達的影響

2.3CCAT1過表達對H2O2誘導的PC12細胞氧化應激水平的影響 與control組相比，H2O2組PC12細胞中MDA含量顯著升高，SOD、CAT、GSH-Px活力顯著降低(P<0.05)；與H2O2+pcDNA-control組相比，H2O2+pcDNA-CCAT1組PC12細胞中MDA含量顯著降低，SOD、CAT、GSH-Px活力顯著升高(P<0.05)。見表3。可見，CCAT1過表達可降低H2O2誘導的PC12細胞氧化應激水平。

表3 CCAT1過表達對H2O2誘導的PC12細胞氧化應激水平的影響

2.4CCAT1過表達對H2O2誘導的PC12細胞Akt/mTOR/STAT3信號通路的影響 與control組相比，H2O2組PC12細胞中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、STAT3、p-STAT3表達水平均顯著降低(P<0.05)；與H2O2+pcDNA-control組相比，H2O2+pcDNA-CCAT1組PC12細胞中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、STAT3、p-STAT3表達水平均顯著升高(P<0.05)。見表4，圖3。可見，CCAT1過表達激活H2O2對PC12細胞Akt/mTOR/STAT3信號通路的抑制。

表4 CCAT1過表達對H2O2誘導的PC12細胞Akt/mTOR/STAT3信號通路的影響

圖3 CCAT1過表達對H2O2誘導的PC12細胞Akt/mTOR/STAT3信號通路的影響

2.5抑制Akt/mTOR/STAT3信號通路逆轉CCAT1過表達對H2O2誘導的PC12細胞增殖和凋亡的影響 與H2O2+pcDNA-CCAT1組相比，H2O2+pcDNA-CCAT1+RAPA組PC12細胞凋亡率顯著升高，Bax表達水平顯著升高，Bcl2表達水平顯著降低，細胞活力顯著降低(P<0.05)。見圖4，圖5，表5。可見，抑制Akt/mTOR/STAT3信號通路逆轉CCAT1過表達對H2O2誘導的PC12細胞增殖促進和凋亡抑制的作用。

圖4 抑制Akt/mTOR/STAT3信號通路逆轉CCAT1過表達對H2O2誘導的PC12細胞凋亡的影響

圖5 抑制Akt/mTOR/STAT3信號通路逆轉CCAT1過表達對H2O2誘導的PC12細胞凋亡相關蛋白表達的影響

表5 抑制Akt/mTOR/STAT3信號通路逆轉CCAT1過表達對H2O2誘導的PC12細胞增殖和凋亡的影響

2.6抑制Akt/mTOR/STAT3信號通路逆轉CCAT1過表達對H2O2誘導的PC12細胞氧化應激水平的影響 與H2O2+pcDNA-CCAT1組相比，H2O2+pcDNA-CCAT1+RAPA組PC12細胞中MDA含量顯著升高，SOD、CAT、GSH-Px活力顯著降低(P<0.05)，見表6。可見，抑制Akt/mTOR/STAT3信號通路逆轉CCAT1過表達對H2O2誘導的PC12細胞氧化應激水平的抑制作用。

表6 抑制Akt/mTOR/STAT3信號通路逆轉CCAT1過表達對H2O2誘導的PC12細胞氧化應激水平的影響

3 討 論

機體內氧化應激平衡狀態的破壞可造成體內生物大分子損傷，導致細胞凋亡，從而誘發包括神經性疾病的發生。因此，降低機體內的氧化應激反應可保護其引起的細胞損傷導致的相關疾病〔12，13〕。SOD、CAT、GSH-Px均是抗氧化酶，SOD是機體內天然清除氧自由基的酶，CAT是一種末端氧化酶，能催化H2O2分解，GSH-Px是機體內重要的抗氧化劑，也可清除自由基；脂質過氧化物催化裂解產生MDA，MDA對細胞具有毒性作用，可誘導細胞凋亡，SOD可將MDA還原成H2O2，進而被CAT和GSH-Px催化還原為對人體無害的水和氧氣，從而維持機體內氧化應激水平〔14〕。本研究結果說明H2O2可降低PC12細胞活力，促進氧化應激的產生和細胞凋亡。有研究顯示提高細胞中SOD、CAT、GSH-Px活性可改善心肌細胞氧化損傷〔15〕。五味子乙素可降低小鼠腦組織MDA含量，提高CAT、SOD和GSH-Px活性，從而減輕氧化損傷〔16〕。本研究結果說明過表達CCAT1可降低H2O2引起的氧化應激水平。

有研究報道顯示右美托咪定通過上調CCAT1可保護肝細胞免受缺氧或缺血-再灌注損傷〔17〕。CCAT1在雙側坐骨神經慢性收縮損傷大鼠中下調表達，上調CCAT1能減輕神經性疼痛〔18〕。本研究結果說明CCAT1過表達可抑制H2O2誘導的細胞凋亡，保護H2O2引起的氧化損傷。

Akt是一個關鍵信號節點，mTOR是Akt下游的一個信號分子，活化的Akt可磷酸化mTOR，mTOR被激活后可促進細胞增殖，抑制細胞凋亡〔19〕；STAT3可被活化的mTOR激活，活化的STAT3也可調控細胞的增殖、分化和凋亡等過程〔20〕。有研究發現三磷酸腺苷可通過激活Akt/mTOR/STAT3信號轉導通路促進脊髓損傷修復〔21〕；miR-99b-5p抑制劑能夠上調Akt/mTOR/STAT3信號通路通過抑制神經細胞凋亡，抑制星形膠質細胞生長和促進神經軸突生長來修復損傷的脊髓神經元〔22〕。白藜蘆醇可通過激活JAK2/STAT3和PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制神經細胞的凋亡，保護大腦缺血再灌注損傷〔23〕。本研究結果說明H2O2可阻斷Akt/mTOR/STAT3信號通路，而過表達CCAT1激活Akt/mTOR/STAT3信號通路。且用Akt/mTOR/STAT3信號通路的抑制劑雷帕霉素處理后可逆轉CCAT1過表達對H2O2誘導的PC12細胞增殖促進和凋亡、氧化應激水平的抑制作用。結果表明CCAT1可能通過調控Akt/mTOR/STAT3信號通路影響細胞增殖、凋亡和氧化應激。

綜上，過表達CCAT1可促進PC12細胞增殖、抑制H2O2誘導的細胞凋亡和氧化應激，其機制可能與Akt/mTOR/STAT3信號通路相關。