海南西瓜蔓枯病病原菌的鑒定及8種殺菌劑對其室內毒力測定

杜公福，李漢豐，詹園鳳，黃小龍，戚志強，黨選民

（1.中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，海南?？?，571101；2.中國熱帶農業科學院；3.海南大學）

西瓜是海南的特色產業，以反季節種植為主，種植面積約1.5 萬hm2[1]，以露地栽培和小拱棚栽培為主。海南地區可全年種植西瓜，但由于生產區連年種植，連作障礙日益加重，加上高溫高濕的環境，易引發土傳病害。近幾年西瓜蔓枯病頻發，已成為海南西瓜重要的土傳病害之一，顯著降低了西瓜產量和品質。西瓜蔓枯病作為一種侵染西瓜的世界性病害，在西瓜整個生育期均可發生，該病害主要通過土壤和灌溉等途徑傳播，空氣濕度高更有利于病菌孢子的存活和傳播，對西瓜生產造成嚴重影響。研究顯示，西瓜蔓枯病病株率一般為15%～25%，嚴重時高達80%，能在短時間內使藤蔓枯死，病蔓率10%，嚴重發生時可減產15%[2～4]。

儋州市是海南西部最大的城市，光村、王五鎮等沿海地區非常適合種植西瓜，常年種植的品種有84-24、友都等麒麟瓜和瓊麗等精品小西瓜，西瓜產業已經成為儋州市的瓜菜新產業。課題組于2016-2017 年在儋州市寶島新村西瓜生產區發現西瓜莖蔓開裂并密生小黑點，田間調查發現主要為害莖基部，病株率約30%。為明確該病的病原菌，本文對海南地區引起西瓜莖蔓開裂病害的病原菌進行了分離、鑒定，并開展藥劑篩選試驗。

國內抗蔓枯病的西瓜品種較少，尤其是抗蔓枯病的中小型西瓜品種[5]。生產中，西瓜蔓枯病以化學防治為主。查詢中國農藥信息網發現，國內登記用于防治蔓枯病的藥劑較少，有效成分主要是雙胍三辛烷基苯磺酸鹽、啶氧菌酯、嘧菌酯、代森錳鋅、苯醚甲環唑等，市場上單劑或復配農藥產品約有30個產品，相關藥效的研究報道較少。為了提高西瓜蔓枯病的防效，避免盲目用藥，選擇其中具有代表性的8種藥劑，對西瓜蔓枯病菌進行室內毒力測定，篩選防治西瓜蔓枯病的理想藥劑，以期為防治西瓜蔓枯病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

樣本來源于儋州市寶島新村露地西瓜病株，品種為友都（海南富友種苗有限公司）。

1.2 供試培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基。

1.3 供試殺菌劑

22.5%啶氧菌酯懸浮劑（SC）：上海杜邦農化有限公司；46%氫氧化銅水分散粒劑（WDG）：上海杜邦農化有限公司；10%苯醚甲環唑WDG：先正達（蘇州）作物保護有限公司；27%春雷·溴菌腈可濕性粉劑（WP）：陜西湯普森生物科技有限公司；24%雙胍·吡唑酯WP：陜西上格之路生物科學有限公司；50%多菌靈WP：江蘇龍燈化學有限公司；18.7%丙環·嘧菌酯SC：瑞士先正達作物保護有限公司；11%精甲·咯·嘧菌懸浮種衣劑（FSC）：先正達（南通）作物保護有限公司。

1.4 病原菌分離純化及致病性測定

2017 年3 月將發病西瓜植株帶回實驗室，對發病部分進行病原菌分離，切取發病組織，用75%乙醇消毒，然后用無菌水清洗，將清洗過的組織晾干后移到PDA 平板中，置于生化培養箱于25℃黑暗條件下培養。待長出菌落后，用接種針挑取菌絲體進行純化和轉接培養；將純化的菌種（編號為MK06）接種到黃瓜果實上[6]，放入接種盒中保濕[7]，置于25℃生化培養箱中培養（每天光照12 h）7 d左右，當產生大量孢子時，用毛刷或刀片將孢子刮到無菌水中，用2 層紗布過濾菌液，采用血球計數板在光學顯微鏡下計算菌液濃度，使用無菌水將菌液配制成孢子含量為1×106個/mL 的菌懸液。

采取柯赫氏法則進行致病性測定。將上述配好的菌懸液用噴霧法接種到具3～4 片真葉的健壯西瓜幼苗上，對照采用無菌水噴霧，設置3 次重復，每重復10 株，將接種后的植株放于26～28℃玻璃柜中，保濕。待接種植株發病后進行調查，并對發病株進行病原菌的再次分離和鑒定。

1.5 病原菌鑒定

挑取純化好的菌絲在PDA 培養基上培養，采用CTAB 法進行病原菌DNA 的提取和純化，送PCR 產物至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。對測序結果進行同源性比對分析，并用Mega 7.0 構建系統發育樹。

1.6 毒力測定

根據菌絲生長抑制預試驗結果，各藥劑設置5個濃度（表1），配制成供試藥劑母液，進行毒力測定，每個濃度3 次重復（平板），每重復3 個平板，以不加藥劑但含等量無菌水的PDA 平板為對照。采用十字交叉法測量菌落直徑，以平均值代表菌落大小。

表1 8種藥劑及其濃度梯度

1.7 數據處理

利用第7 天的平均菌落直徑凈增長值，分別計算每種藥劑各個濃度的實際抑制率，然后建立回歸方程，參考慕立義[8]的算法，根據最小二乘法求出EC50值。

抑制率（%）=（對照菌落直徑平均數-處理菌落直徑平均數）/對照菌落直徑平均數×100。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

葉片剛染病時，出現水漬狀小斑點，然后慢慢形成灰褐至黃褐色小圓斑，病斑邊緣顯現黃色暈圈；隨著病情發展，病斑中間變成灰白色，濕度大時會有小黑點著生，病斑中心容易干裂。莖蔓染病時，病斑多呈不規則長條形，病健交界處稍凹陷，淺灰褐色至深褐色，濕度大時有小黑點（圖1），后引起莖蔓縱裂，嚴重時導致植株凋萎。

圖1 田間發病癥狀

2.2 致病性測定

根據柯赫氏法則進行致病性測定，在西瓜上接種病菌后第7 天，西瓜葉片開始表現出病狀，其莖基部變為黃褐色，向內縊縮，并有開裂癥狀，一段時間后葉片萎蔫枯死（圖2）。接種發病癥狀與田間觀察相同，對照西瓜植株沒有出現病癥。將發病西瓜葉片上的病斑進行組織分離，獲得的病原菌與原接種菌MK06 一致。

圖2 致病性測定

2.3 病原菌鑒定

菌株MK06 在PDA 培養基上菌落正面近圓形，菌絲灰白色，似輪紋狀擴展（圖3），菌落背面可見輻射狀墨綠色菌絲（圖4）。分生孢子器近球形，直徑65.0～150.0 μm，成熟遇水時釋放出大量分生孢子（圖5），并可形成孢子鏈。分生孢子有單孢形和雙孢形2種形態，孢子兩端鈍圓，無色，卵圓形或圓柱形，平均大小為5.2 μm×2.1 μm（圖6）。該病菌的形態特征與陸家云[9]描述的Phoma cucurbitacearum（與Stagonosporopsis cucurbitacearum同物異名）的形態特征相似。

圖3 菌落正面

圖4 菌落背面

圖5 分生孢子器（200 倍顯微）

圖6 分生孢子（400 倍顯微）

2.4 病原菌的rDNA-ITS 序列分析

利用測序出的病原菌MK06 的ITS 基因序列構建系統發育進化樹，顯示菌株MK06 與Stagonosporopsis cucurbitacearum（MF401571.1、HQ914649.1、EU167573.1）聚在同一個分支上（圖7），與已報道的Stagonosporopsis cucurbitacearum同源性達100%。根據形態學特征及分子測序比對，鑒定西瓜蔓枯病菌為Stagonosporopsis cucurbitacearum。

圖7 病原菌ITS 系統發育樹分析

2.5 藥劑毒力測定結果

由表2 可知，24%雙胍·吡唑酯WP 和11%精甲·咯·嘧菌FSC 的毒力較強，EC50值分別為0.101 7、0.391 1 mg/L，均小于1 mg/L；其次是10%苯醚甲環唑WDG 和18.7%丙環·嘧菌酯SC，EC50值分別為1.393 3、3.037 6 mg/L；27%春雷·溴菌腈WP 和22.5%啶氧菌酯SC 毒力效果一般，EC50值分別為10.753 0、20.982 6 mg/L；毒力效果較差的為46%氫氧化銅WDG 和50%多菌靈WP，EC50值分別為60.703 9、151.477 0 mg/L。

表2 8種藥劑對西瓜蔓枯病菌的室內毒力測定結果

3 結論與討論

西瓜蔓枯病是毀滅性病害，世界各地均有相關報道，但其病原菌的命名比較混亂，頗具爭議。1885年Giovanni Passerini 首次在甜瓜上分離到蔓枯病菌，并將病原菌命名為Didymella melonisPass.[10]。1891 年，William Dudley、Casimir Roumeguere 和Frederick Chester 3 位真菌學者分別在美國黃瓜、法國黃瓜、美國西瓜植株上發現該菌，并根據其寄主植物及分生孢子形態分別命名為：Phyllosticta cucurbitacearumSacc.，Ascochyta cucumisFautr.&Roum.以及Phyllosticta citrullinaChester[11，12]。

早期國內學者裘維番等根據病菌的形態學特征，將甜瓜等葫蘆科植物蔓枯病菌鑒定為瓜類球腔菌Mycosphaerella melonis，其無性型為殼二孢屬（Ascochyta）[13～16]。國際上多使用有性態為亞隔孢殼屬的瓜類黑腐球殼菌Didymella bryoniae（Auersw.）Rehm.，無性態為莖點霉菌Phoma cucurbitacearum（Fr）Sacc.[17]。到2010 年，Aveskamp 等[18]利用形態學和分子標記方法，把Phoma細分出眾多分支，認為蔓枯病菌無性態應命名為Stagonosporopsiscucurbitacearum（Fr.）Aveskamp Gruyter &Verkley。然而，另有一些學者認為在大多蔓枯病菌寄主植物上既可以發現其無性孢子也能發現其有性子實體，所以劃分有性型和無性型意義不大。2015 年，Stewart 等[19，20]在Aveskamp和Garampalli 的研 究基礎上，發現蔓枯病菌Satgonosporopsis由3 個親緣關系相近且形態學難以區分的種組成，分別是Satgonosporopsis cucurbitacearum、Satgonosporopsis citrulli和Satgonosporopsis caricae。根 據Stewart等[19，20]對蔓枯病菌最新的分類方法，譚蕊[21]對西南地區274株西瓜進行蔓枯病病原菌鑒定，其中234株病原菌為Satgonosporopsis citrulli，40 株 為Satgonosporopsis caricae，未見Satgonosporopsis cucurbitacearum，Satgonosporopsis citrulli為優勢種，且不同菌種間致病力、產孢能力具有一定差異。本研究收集鑒定的西瓜蔓枯病菌為Satgonosporopsis cucurbitacearum，結合譚蕊[21]研究認為，我國西瓜蔓枯病病原確實存在3 個致病種，且不同地理區域優勢種群可能不同。目前正在收集海南地區西瓜蔓枯病菌株，以期明確優勢種群，為西瓜抗病育種及防治提供理論基礎。

當前生產上，用于防治西瓜蔓枯病的藥劑比較單一，很容易使病原菌產生抗藥性。尤其是作用位點單一的內吸性藥劑，如長期大量防效下降或失效[22]。國外已報道西瓜蔓枯病菌對嘧菌酯[23]、甲基硫菌靈和苯菌靈[24]產生了抗藥性，國內已報道西瓜蔓枯病菌對多菌靈產生抗藥性[25]。在室內毒力測定試驗中，本研究結果與李雨等[2]的測定結果基本一致，苯醚甲環唑和含吡唑醚菌酯的藥劑抑菌活性較好。而其他甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑（啶氧菌酯）及多菌靈抑菌活性較差，這與Liu 等[25]的結果相似。因此，建議在西瓜生產中選擇24%雙胍·吡唑酯WP 和11%精甲·咯·嘧菌FSC 防治蔓枯病，盡量避免長期使用作用位點單一的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑單劑（嘧菌酯、肟菌酯、醚菌酯等），或選擇其復配藥劑，延長藥劑使用壽命，保證殺菌效果[26，27]。