HRCT征象聯合TTF-1用于區分不同浸潤程度的磨玻璃結節樣肺腺癌＊

1.南方醫科大學順德醫院(佛山市順德區第一人民醫院)放射科(廣東 佛山 528308)

2.南方醫科大學順德醫院(佛山市順德區第一人民醫院)呼吸科(廣東 佛山 528308)

張 榕1 楊少民1 郭保亮1 歐陽富盛1 劉子蔚1 周翠銣1 肖 強2 胡秋根1,*

隨著工業化和城市化的進展，肺癌已經從罕見疾病轉變為全球性公共衛生問題[1]。據估計，每年約有1800萬人被診斷出患有肺癌，且5年生存率僅約4%～17%[2]。近年來，對肺癌基因組學的了解使得肺癌的治療取得實質性進展。然而，挑戰仍然存在，因為早期肺癌的共識性檢測方法仍然難以捉摸[3]。其中，直徑小于2cm的磨玻璃結節樣肺腺癌(small ground glass nodular lung adenocarcinoma，GGNs)的清晰顯示高度依賴于CT掃描和后處理技術。普通CT無法顯示GGNs或清晰顯示，因此，GGNs的早期檢測存在很大的限制[4]。而高分辨率計算機斷層掃描(high-resolution computed tomography，HRCT)，一種非破壞性技術，可進行3D成像和各種物體內部特征的分析，具有良好的敏感性和特異性[5]。根據解剖分布，HRCT征象可大致分為四類：實質、氣道、血管和胸膜征[6]，可以更清晰地顯示GGNs[3-4]，并有助于胸外科醫師明確更合理的切除范圍[7]。因此，本文旨在進一步評估HRCT征象對于預測GGNs浸潤程度的臨床價值。此外，本研究進一步分析了HRCT征象與肺癌臨床相關免疫組化指標的相關性，以期進一步提高GGNs患者的早期診斷和及時治療。

1 資料與方法

1.1 臨床資料回顧性分析2019年1月至2020年5月于我院進行HRCT掃描的144例(男46例，女98例)GGNs患者，最小年齡為28歲，最大年齡為80歲，平均年齡為(51.9±11.9)歲。根據2015年WHO制定的肺腺癌新分類[8]，將144例患者分為三組：浸潤前病變(pre-invasive lesion，PI)組(n=35)(圖1)微浸潤性腺癌(microinvasive adenocarcinoma，MIA)組(n=46)(圖2)和浸潤性腺癌(invasive adenocarcinoma，IA)組(n=63)(圖3)。此外，收集了144例患者的免疫組化切片，通過顯微鏡隨機拍攝每個樣本的3個視野并通過Image J打開圖片(400倍)。然后，根據圖片灰度值與OD(optical density)值進行轉換，取平均值作為基因的相對表達以進行后續統計分析。本項研究獲得了所有患者的知情同意以及我院倫理委員會的批準。

1.2 檢查方法使用SIEMENS Somatom Definition AS 128層CT機(西門子，德國)進行HRCT靶掃描檢查，掃描的上下范圍由肺尖到膈面，左右范圍包括兩側腋窩及胸壁。HRCT靶掃描的具體參數：掃描視野(FOV)180mm×180mm，管電流300mA，管電壓120kV，螺距(pitch)0.8mm，準直0.6mm×128，掃描時間1.91s，重建厚度0.6mm，圖像矩陣512×512，掃描結束將原始圖像傳送至后平臺，再進行多平面重建(MPR)和容積重組(VR)等后處理進行閱片。所有圖像傳入SIEMENS后處理工作平臺進行重建，并由兩位高年資醫生以雙盲法進行閱片。在薄層圖像及重建圖像取最大合適截面進行參數測量，每個樣本測量三次并取平均值。

1.3 統計學分析所有統計分析均采用SPSS22.0軟件進行。符合正態分布的測量數據以()表示，并通過單因素方差分析和無序多分類logistic回歸分析比較三組患者的HRCT征象。使用獨立樣本t檢驗進行組間比較。使用R語言軟件4.1.0版本繪制小提琴圖和熱圖。P<0.05被認為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 三組患者HRCT征象的單因素分析如表1所示，三組患者的GGNs平均大小、GGNs平均密度、分葉征、毛刺征、胸膜牽拉征、瘤-肺邊界、微血管穿行征及空氣支氣管征均有顯著的差異(P<0.05)。然而，空泡征在三組患者中無顯著差異(P>0.05)。

2.2 三組患者HRCT征象的無序多分類Logistic回歸分析為進一步驗證單因素分析篩選出來的自變量對不同浸潤程度肺腺癌的影響，引入了無序多分類Logistic回歸模型。模型Ⅰ：MIA組(參照=PI組),模型Ⅱ：IA組(參照=PI組)和模型 Ⅲ：MIA組(參照=IA組)。由表2可知，所建立模型的擬合優度檢驗結果較好且有效。如表3所示，在模型Ⅰ中，與PI組相比，MIA組的GGN平均大小和空氣支氣管征均具有顯著差異(P<0.05)；在模型Ⅱ中，與PI組相比，IA組GGNs平均大小、分葉征、瘤-肺邊界和空氣支氣管征均差異顯著(P<0.05)；在模型Ⅲ中，與IA組相比，MIA組GGNs平均大小、分葉征、毛刺征和瘤-肺邊界均差異顯著(P<0.05)。結合數據看:除了GGNs平均大小，其他單獨的HRCT征象不足以成為區分PI、MIA和IA病變的獨立因素。

表3 影響浸潤程度的無序多分類logistic回歸分析結果

圖1～3 三組患者HRCT征象和HE染色的示意圖。圖1 為PI組，右肺下葉外基底段見一大小約5mm×5mm磨玻璃結節，周圍可見微血管穿行，病灶內見空泡征；術后病理：符合原位癌（浸潤前病變）。圖2 為MIA組，右下肺前基底段見一大小約9mm×10mm磨玻璃結節，病灶邊緣可見微血管穿行，邊界顯示清晰，微血管壁顯示毛糙，病灶邊緣見少許短毛刺，病灶中央見空泡征；術后病理：微浸潤性腺癌。圖3 為IA組，右上肺見一大小約22mm×16mm純磨玻璃結節，常規CT掃描顯示邊界稍模糊，病灶內見微血管穿行及小空泡影；術后病理：浸潤性肺腺癌。

2.3 HRCT征象與肺癌相關蛋白的對比分析如圖4所示，與PI組相比，10個肺癌相關的臨床指標CEA、EGFR、VEGF、NapsinA、CK7、TTF-1、CK5/6、P53、Ki67和P40在MIA組和IA組均顯著升高(P<0.05)。進一步根據HRCT征象對這144個樣本進行分類(圖5)：(1)與GGNs平均大小≤10mm組相比，GGNs平均大小>10mm組中10個肺癌相關的臨床指標均顯著升高(P<0.05)；(2)與GGNs平均密度≤-425HU組相比，GGNs平均密度>-425HU組中僅TTF-1顯著增加(P<0.05)；(3)與分葉征陰性組相比，分葉征陽性組中CEA、VEGF、NapsinA、CK7、CK5/6、P53、P40的表達均顯著下降，然而EGFR、TTF-1和Ki67的表達均顯著增加(P<0.05)；(4)與毛刺征陰性組相比，毛刺征陽性組中10個肺癌相關的臨床指標的表達均顯著升高(P<0.05)；(5)與胸膜牽拉征陰性組相比，胸膜牽拉征陽性組中TTF-1和Ki67的表達均顯著升高，然而，P53和P40的表達均顯著下降(P<0.05)；(6)與瘤-肺邊界陰性組相比，瘤-肺邊界陽性組中10個肺癌相關的臨床指標均顯著升高(P<0.05)；(7)與微血管穿行征陰性組相比，微血管穿行征陽性組中CEA和TTF-1的表達均顯著升高，然而，EGFR、VEGF、NapsinA、CK7和P53的表達均顯著下降(P<0.05)；(8)與空氣支氣管征陰性組相比，空氣支氣管征陽性組中TTF-1和Ki67均顯著升高且CK5/6、P53和P40均顯著下降(P<0.05)；(9)與空泡征陰性組相比，空泡征陽性組中10個肺癌相關的臨床指標均無顯著差異(P>0.05)。結合數據看:肺癌相關的臨床指標結合HRCT征象可以提高PI、MIA和IA病變的分辨率。

圖4 免疫組化檢測三組患者中10個肺癌相關臨床指標:CEA、EGFR、VEGF、NapsinA、CK7、TTF-1、CK5/6、P53、Ki67和P40的蛋白表達水平。Mann Whitney test結果顯示，與PI組相比，MIA組中這10個肺癌相關臨床指標均顯著高表達。此外，與MIA組相比，這10個肺癌相關臨床指標在IA組中顯著高表達。備注：*代表P<0.05，**代表P<0.001，***代表P<0.0001。圖5 這10個肺癌相關臨床指標：CEA、EGFR、VEGF、NapsinA、CK7、TTF-1、CK5/6、P53、Ki67和P40在HRCT征象陽性和陰性組中的表達情況。

3 討 論

近年來，隨著HRCT的廣泛應用，GGNs的檢出率明顯增加[8-9]，從而將PI和MIA患者的5年生存率提高到100%[9]。然而GGNs的檢出率并非100%，于是，一些諸如分葉征、毛刺征和胸膜牽拉征等HRCT征象也常用于區分PI、MIA和IA病變[4]。因此，評估HRCT征象對于區分PI、MIA和IA病變具有重要的臨床意義，有助于提高肺腺癌患者的生存期和生活質量。

GGNs的大小和密度一直被認為是肺腺癌病變程度的兩個重要指標[10]。有研究指出，大于8.12mm且密度大于-449.52HU的GGNs與IA病變密切相關[11]。在本研究中，單因素分析結果顯示GGNs平均大小和平均密度在三組患者中均有顯著的差異(P<0.05)。其中，PI組平均大小和平均密度分別為(5.03±1.52)mm和(-534.61±328.35)HU，MIA組GGNs平均大小和平均密度分別為(7.80±2.01)mm和(-485.09±100.50)HU，IA組GGNs平均大小和平均密度分別為(11.76±3.10)mm和(-307.87±147.07)HU。然而，無序多分類logistic回歸分析結果顯示，僅GGNs平均大小可以作為區分PI、MIA和IA病變的獨立因素，與Eguchi等[12]的研究報道一致。結合本研究結果可知：GGNs平均大小大于(7.80±2.01)mm和大于(11.76±3.10)mm，可作為預測MIA和IA病變的獨立危險因素。

除了GGNs的大小和密度，諸如分葉征、毛刺征和胸膜牽拉征等其他HRCT征象也與肺癌的發生和發展密切相關[13-14]。隨著GGNs浸潤程度的增加，病灶細胞的生長速度加快，分葉征和毛刺征也逐漸出現[15]。在本研究中，單因素分析結果顯示分葉征和毛刺征在三組患者中均有顯著的差異(P<0.05)，提示分葉征和毛刺征對于區分GGNs浸潤程度具有一定的輔助價值。無序多分類logistic回歸分析結果顯示，與PI組相比，IA組中分葉征(P=0.047)顯著增加而毛刺征無顯著差異(P=0.259)；與IA組相比，MIA組中分葉征(P=0.009)和毛刺征(P=0.000)均顯著變化；然而，分葉征(P=0.473)和毛刺征在(P=0.191)PI組和MIA組中無顯著差異。總體來說，本研究結果表明分葉征和毛刺征可作為區分MIA和IA病變的獨立因素，然而，由于本研究樣本數量的限制，需要擴大樣本進一步明確分葉征和毛刺征對于區分PI/IA病變和PI/MIA病變的臨床價值。

Lee等[16]報告顯示，在PI病變和IA病變之間胸膜牽拉征象的分布沒有明顯的差異。然而，本研究中，單因素分析結果顯示，PI組(0/35)、MIA組(19/46)和IA組(43/63)出現胸-膜牽拉征的病例數量具有顯著差異(P=0.000)，提示了胸-膜牽拉征在評估GGNs浸潤程度方面具有一定的臨床價值。在Lee等[16]的研究中，HRCT的重建厚度為1.0～2.5mm，而在本研究中HRCT的重建厚度為0.6mm。此外，本研究做了靶掃描以及冠狀和矢狀后處理重建技術，在不同方位可更清晰地顯示影像特征。因此，本研究結果對于胸-膜牽拉征的檢測更加精準。然而，進一步的無序多分類logistic回歸分析結果顯示，三組患者的胸-膜牽拉征無顯著差異(P>0.05)，提示胸-膜牽拉征可作為區分GGNs浸潤程度的非獨立性輔助指標，需要聯合其他HRCT征象加以佐證。

肺瘤-肺邊界征象的出現往往提示GGNs存在惡性病變可能[17]。微血管穿行征和空氣支氣管征也與肺癌的進展密切相關[4,18]。在本研究中，單因素分析結果同樣表明瘤-肺邊界，微血管穿行征和空氣支氣管征在三組患者中均有顯著的差異(P<0.05)。然而，無序多分類logistic回歸分析結果顯示：(1)與PI組相比，IA組中瘤-肺邊界的病例顯著增加(P=0.004)；與IA組相比，MIA組中瘤-肺邊界的病例顯著增加(P=0.011)；然而瘤-肺邊界的征象在PI組和MIA組中無顯著差異(P=0.410)，提示瘤-肺邊界可以作為區分PI/IA病變和MIA/IA病變的獨立指標，然而不適用于作為區分PI/MIA病變的獨立因素。(2)微血管穿行征在PI組、MIA組和IA組中無顯著差異(P<0.05)，提示微血管穿行征僅可以作為區分PI、MIA和IA病變的輔助指標。(3)與PI組相比，MIA組(P=0.000)和IA組中空氣支氣管征(P=0.000)顯著增加，然而空氣支氣管征在MIA組和IA組中無顯著差異(P=0.805)，提示空氣支氣管征可以作為區分PI病變和MIA/IA病變的獨立危險因素，然而僅可作為區分MIA和IA病變的輔助指標。結合以上數據來看：除了GGNs的大小，其他的HRCT征象不能完全適用于作為評估GGNs病變類型的獨立指標。因此，本研究希望通過結合其他臨床指標，進一步提高HRCT征象作為診斷GGNs病變類型的臨床價值。

肺癌相關的臨床指標CEA[19]、EGFR[20]、VEGF[21]、NapsinA[22]、CK7[23]、TTF-1[24]、CK5/6[25]、P53[26]、Ki67[27]和P40[28]常用于評估肺癌的發生和發展。在本研究中，與PI組相比，這10個肺癌相關的臨床指標在MIA組和IA組均顯著升高(P<0.05)。因此，進一步評估這些肺癌相關臨床指標與HRCT征象的相關性，以進一步區分PI、MIA和IA病變。

本研究結果顯示，與相應的對照組相比，在GGNs平均大小>10mm組、毛刺征陽性組和瘤-肺邊界征陽性組中CEA、EGFR、VEGF、NapsinA、CK7、TTF-1、CK5/6、P53、Ki67和P40均顯著升高(P<0.05)，表明GGNs平均大小>10mm，毛刺征和瘤-肺邊界征結合這10個肺癌相關臨床指標的異常升高有助于進一步明確GGNs病變類型的臨床診斷。然而，在胸膜牽拉征陽性組中僅TTF-1和Ki67的表達顯著升高(P<0.05)；在微血管穿行征陽性組中僅CEA和TTF-1的表達顯著升高(P<0.05)。此外，在空氣支氣管征陽性組中僅TTF-1和Ki67顯著升高(P<0.05)。這提示胸膜牽拉征和空氣支氣管征聯合高表達的TTF-1和Ki67；微血管穿行征聯合高表達的CEA和TTF-1，有助于進一步提高PI、MIA和IA病變的診斷率。基于以上臨床分析，發現TTF-1的異常升高與所有HRCT征象密切相關。研究報道由NKX2-1編碼的TTF-1是調節肺形態和肺上皮細胞分化的主轉錄因子，在小細胞肺癌和肺腺癌中均高表達且與不良預后相關[29-30]。因此，可推測TTF-1的高表達是肺癌患者出現異常HRCT的潛在因素。

總之，HRCT征象聯合高表達的TTF-1有助于進一步預測GGNs中的PI、MIA和IA病變。然而，本研究未對所納入病例的性別和年齡等相關指標進行分層分析，需要擴大樣本進行前瞻性隊列分析，以進一步明確HRCT征象聯合肺癌相關的臨床指標對于評估GGNs浸潤程度的臨床價值，以及更細致的病人適用范圍。