基于網絡藥理學探討黃連溫膽湯治療失眠的機制

雷勵飛 韓冠先 關東升 趙凰宏 毛亞瑞 李佳貞 曹鈺珂 吳帥

失眠癥是以頻繁而持續的入睡困難和(或)睡眠持續困難并導致睡眠感不滿意為特征的睡眠障礙[1]，國際上的一項調查研究發現，在成人中失眠癥的發病率高達10%～15%，其中近一半嚴重失眠患者病程可持續10年以上[2]，而專門針對中國內地成年人的一項調查研究發現，失眠癥的發病率高達57%[3]。

黃連溫膽湯是在南宋·陳言《三因極一病證方論》溫膽湯的基礎上去大棗加黃連化裁而來，最早見于清·陸廷珍《六因條辨》卷上，該方由黃連、半夏、茯苓、陳皮、枳實、竹茹、生姜、甘草八味藥組成，可化痰清熱、和中安神而治療不寐痰熱內擾證。《古今醫統大全》中記載：“痰火擾亂，心神不寧，思慮過傷、火熾痰郁而致不眠者，多矣。”可見因痰熱內擾證而至不寐者較多。臨床試驗研究已經證明黃連溫膽湯治療痰熱內擾型失眠確有療效，能夠改善患者的睡眠質量，且預后效果好，臨床安全[4]。現代藥理研究發現黃連溫膽湯具有鎮靜催眠、抗焦慮、調節大腦興奮和抑制的作用[5]。網絡藥理學從多成分、多靶點、多途徑角度研究問題，與中藥強調方藥配伍、聯合用藥的思想契合。在中藥的研究中應用網絡藥理學具有獨特的優勢[6]。本研究借助網絡藥理學，以“胃不和則臥不安”為理論基礎，對中藥復方黃連溫膽湯治療失眠的主要有效成分和關鍵靶點進行預測，探討其治療失眠的作用機制。

1 材料與方法

1.1 黃連溫膽湯藥物歸經的收集歸納 從《中國藥典》《得配本草》《雷公炮制藥性解》等文獻資料中獲取黃連溫膽湯的藥物歸經，收集歸納并繪制表格。

1.2 有效成分及其作用靶點的篩選 在中藥系統藥理學數據庫和分析平臺TCMSP(http：//sp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)中以“黃連”“半夏”“茯苓”“陳皮”“枳實”“生姜”“甘草”為關鍵詞，以口服生物利用度OB≥30%、類藥性DL≥0.18為滿足條件進行檢索，收集藥物有效成分和作用靶點。在Uniprot(https：//www.uniprot.org/)數據庫中，將靶點物種限定為人，對所有中藥靶點基因進行注釋。最后利用Cytoscape 3.7.2軟件構建“藥物-靶點-有效成分”網絡圖。

1.3 藥物與疾病交集靶點篩選 在Genecards(https：//www.genecards.org/)數 據 庫 以“insomnia(失眠癥)”為關鍵詞，檢索并收集相關的疾病靶點，將藥物關鍵靶點與疾病靶點輸入Venny(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)平臺，得到藥物與疾病交集靶點及韋恩圖。

1.4 關鍵靶點相互作用PPI網絡構建 將藥物與疾病交集靶點輸入STRING(https：//string-db.org/cgi/input.pl) 數據庫，將物種設定為人“Homo Sapiens”，最低相互作用閾值設為“medium confidence(＞0.400)”，其他參數保持默認設置，生成靶點蛋白相互作用關系PPI文件。將所有節點與連線輸入CtoNCA軟件進行拓撲分析，得到核心靶點的基因滿足度(Degree)并繪制表格。

1.5 基因生物過程(GO)富集及基因組百科全書(KEGG) 通路分析 運用R×64 4.0.0軟件的Bioc-Manager等插件包對黃連溫膽湯干預失眠的關鍵基因進行GO富集和KEGG通路分析，并以P＜0.05作為篩選條件。

2 結果

2.1 黃連溫膽湯藥物歸經收集結果 中藥歸經是對藥物作用的定位，指藥物對于機體某部分的選擇性作用。對復方黃連溫膽湯藥物歸經的總結可以將藥物主要作用臟腑的定位可視化。由于部分中藥的歸經仍未統一，并且受作者所處時代的客觀條件限制等原因，文獻記載中的藥物歸經具有思辨性和主觀隨意性[7-8]，因此本研究在獲取黃連溫膽湯的藥物歸經時，收集了《中國藥典》《得配本草》《雷公炮制藥性解》等10部不同年代的文獻資料，使結果更具客觀性和普遍性。藥物歸經結果見表1，黃連溫膽湯的藥物主要歸脾、胃、肺、心經，同時其余各經均有涉及。《中國藥典》有6味歸脾經、5味歸胃經、3味歸心經；《得配本草》有5味歸脾經、5味歸胃經、3味歸心經；《雷公炮制藥性解》有7味歸脾經、4味歸胃經、5味歸心經。

表1 黃連溫膽湯藥物歸經統計 單位：個

2.2 黃連溫膽湯藥物有效成分及作用靶點收集結果 在TCMSP平臺(以OB≥30%、DL≥0.18為滿足條件)進行黃連溫膽湯藥物的檢索，在Uniprot數據庫去重并注釋，共收集到藥物有效成分83個、作用靶點124個，其中藥物有效成分黃連11個，半夏10個，枳實14個，陳皮5個，茯苓6個，生姜3個，甘草40個；將所有數據輸入Cytoscape 3.7.2軟件，構建“藥物-靶點-有效成分”網絡圖，見圖1，將其可視化(如圖1所示：六邊形為藥物，三角形為靶點，菱形為有效成分)。有6個有效成分為兩藥物共有(在圖1中由橢圓形標注)，谷甾醇 (sitosterol)、柚皮苷(naringenin)為陳皮與甘草共有；5，7- 二羥基-2- (3- 羥基-4- 甲氧基苯基) 色滿-4- 酮[5，7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxy-phenyl)chroman-4-one]、川 陳皮素(nobiletin)為陳皮與枳實共有；β- 谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)為生姜與半夏共有。使用CtoNCA軟件進行拓撲分析，得到有效成分滿足度(Degree)，Degree值越高證明該靶點與活性成分結合越好[9]，列出Degree值大于中位數的前17個有效成分[10]，見表2。

圖1 黃連溫膽湯“藥物- 靶點- 有效成分”網絡

表2 黃連溫膽湯主要有效成分

2.3 黃連溫膽湯藥物與疾病作用靶點篩選結果在Genecards數據庫以“insomnia(失眠癥)”為關鍵詞，檢索到2 280個潛在作用靶點，將藥物關鍵靶點與疾病靶點輸入Venny平臺，得到藥物與疾病交集靶點42個，見圖2。得到的42個靶點可能是黃連溫膽湯作用于失眠癥的關鍵靶點。2.4 藥物、疾病共同靶點PPI網絡構建結果 將42個藥物與疾病交集靶點輸入STRING數據庫進行分析，剔除游離點之后共得到40個節點、428條相互作用關系的連線，得到靶點蛋白相互作用節點與連線關系文件。將文件輸入Cytoscape 3.7.2軟件進行拓撲分析，得到核心靶點的基因滿足度(Degree)。按照Degree值大小繪制核心靶點PPI網絡圖，見圖3，排名靠前的靶點可能為本研究的主要作用靶點，并列出Degree值大于中位數的15個靶點，見表3。

表3 PPI網絡核心靶點拓撲分析結果

圖2 藥物與疾病靶點韋恩圖

圖3 共同靶點PPI網絡

2.5 GO基因生物過程富集分析結果 對藥物與疾病共有的42個靶點進行GO生物功能注釋，得到51個富集結果。以P＜0.05為條件選取GO富集分析結果中，與黃連溫膽湯藥物成分作用靶點最為相關的條目20個，并將其可視化，見圖4。如圖4柱狀圖中，以富集的基因數目為坐標，按照富集結果的P值(0.000～0.008)由小到大順序進行排列，越靠上證明P值越小，富集程度越高。因此可以探討出，本研究的共同作用靶點的主要富集條目為核糖核酸聚合酶二轉錄因子結合(RNA polymerase Ⅱtranscription factor binding)，類固醇結合(steroid binding)，hsp90蛋白結合(Hsp90 protein binding)，核受體活性(nuclear receptor activity)，神經遞質結合(neurotransmitter binding)等生物過程。

圖4 共同靶點GO富集分析結果

2.6 KEGG基因通路富集分析結果 對藥物與疾病共有的42個靶點進行KEGG通路分析，得到35條信號通路。以富集靶點數目多少為標準，選取KEGG通路分析結果中靶點數目最多的20條通路，并將其可視化，見圖5。如圖5柱狀圖所示，以富集的基因數目為坐標，按照富集結果的P值(0.000～0.021)由小到大順序進行排列，越靠上證明P值越小，富集程度越高。可以探討出本研究的共同作用靶點主要富集在糖尿病并發癥的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)，卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)，流體剪應力和動脈粥樣硬 (Fluid shear stress and atherosclerosis)，腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)， 催 乳 素 信 號 通 路(Prolactin signaling pathway)等通路上。

圖5 共同靶點KEGG通路分析結果

2.7 “核心靶點- 通路”網絡構建 將KEGG通路分析結果中，以P＜0.05和富集靶點數目兩個標準選取的通路取交集，得到23條通路，共有25個靶點。將所有通路和靶點輸入Cytoscape 3.7.2軟件，構建“核心靶點-通路”網絡圖，使其可視化，見圖6，左側為靶點，右側為通路，根據Degree值將最關鍵靶點顏色加重，因此可以得出IL-6、CCND1、VEGFA、FOS、ICAM1、ERBB2、RB1可能為黃連溫膽湯通過多靶點、多途徑治療“胃不和則臥不安”痰熱內擾證的核心靶點。

圖6 “核心靶點- 通路”網絡

3 討論

《素問·逆調論》中記載“帝曰：人有逆氣不得臥而息有音者……岐伯曰：不得臥而息有音者，是陽明之逆也……陽明者，胃脈也，胃者六腑之海，其氣亦下行。陽明逆，不得從其道，故不得臥也。《下經》曰：胃不和則臥不安，此之謂也。”《素問》中記載：“心者，君主之官也，神明出焉”，《景岳全書·不寐》中有：“心為事擾則神動，神動則不靜，是以不寐也”。胃不和、心神不安則不能入眠[11]。黃連溫膽湯藥物歸經統計結果與經典理論相結合，可證明運用黃連溫膽湯治療“胃不和”引起的“不寐”具有關鍵臟腑選擇性，同時能體現中醫治療疾病的整體觀。胃主收納腐熟食物，胃氣主降，運化水谷，以下行為和。足陽明胃經多氣多血，陽氣充盛，如胃氣不得下行，則陽明經不得從其道，陽不入陰，陰陽不得交納，則夜不能寐。飲食水谷不得運化則留置與胃，胃氣不降反而上逆，出現脘腹痞悶，口苦心煩，不思飲食，口黏痰多，日久化熱，擾亂心神，失眠時作[12]。黃連溫膽湯中取黃連以清熱燥濕，瀉火解毒，為君藥。半夏燥濕化痰、降逆和胃，與竹茹相伍以止嘔除煩，為臣藥。枳實、陳皮燥濕理氣化痰，使氣順則痰消；茯苓利水滲濕，健脾寧心安神；生姜培土和胃且制半夏毒，為佐藥。佐使以甘草，調和諸藥。全方配伍可清熱化痰兼以理氣，氣順痰消，使痰熱之邪可去，脾胃和則神可安，不寐自解。

在對“藥物-靶點-有效成分”網絡拓撲分析的研究中發現槲皮素、川陳皮素、β-谷甾醇、柚皮苷、木犀草素、豆甾醇、黃芩苷等可能為黃連溫膽湯的核心成分，且將黃連溫膽湯的關鍵藥物包含其中，槲皮素為君藥黃連的核心成分，且拓撲分析中Degree值最高，與中醫治療疾病方藥配伍的整體觀與辨證思維相契合。槲皮素，川陳皮素、柚皮苷、木犀草素、黃芩苷均為黃酮類化合物，黃酮類藥物具有抗炎、抗氧化等作用[13]。與睡眠-覺醒周期最密切相關的神經遞質為γ氨基丁酸(GABA)、谷氨酸(Glu)、5- 羥色胺(5-HT)、乙酰膽堿(Ach)、多巴胺(DA)和去甲腎上腺素(NE)等[14]。較早期的研究已經發現，黃酮類化合物能夠作用于大腦皮層、垂體和腦干，能影響5-HT、DA、NE等遞質[15]。槲皮素是廣泛分布的天然類黃酮，研究表明其能與5羥色胺協同延長睡眠時間，縮短睡眠潛伏期，從而起到催眠作用[16]。柚皮苷已被證明能夠減輕炎癥的觸發和多巴胺消耗水平的能力，從而有效減輕包含失眠在內的睡眠障礙[17]。木犀草素可減少睡眠潛伏期并增加總睡眠時間，通過對誘發的小鼠睡眠模型腦電圖(EEG)和肌電圖(EMG)的記錄，證明木犀草素可增加非快速眼動(NREM)睡眠時間并減少了喚醒時間[18]。通過對脊椎動物的實驗研究發現黃芩素提取物通過與GABAA-BZD受體結合，可增加非快速眼動睡眠時間，有效地改善睡眠行為[19]。黃連溫膽湯主要化合成分有較多的黃酮類化合物能夠通過抗炎、抗氧化的作用，對神經遞質進行調節，從而達到治療失眠的效果。

GO基因生物過程及KEGG基因通路富集分析結果，得到與本研究密切相關的生物過程有核受體活性、神經遞質結合通路、核糖核酸聚合酶二轉錄因子結合等，基因通路有腫瘤壞死因子信號通路、HIF-1信號通路、NF-κB信號通路等。結合PPI網絡核心靶點及KEGG基因通路富集分析核心靶點的拓撲分析結果，可知白細胞介素-6(IL-6)、細胞周期素D1(CCND1)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、細胞間黏附分子-1(ICAM1)、低聚果糖(FOS)、雌激素受體1(ESR1)等可能為本研究的核心靶點。IL-6、CCND1、VEGFA、ICAM1、FOS在胃系疾病的發生發展過程中均有重要體現，IL-6、VEGFA能夠抑制促炎因子的生成、使胃黏膜血流量增多、促進黏膜細胞增殖因子和保護因子蛋白的表達[20]。并且有研究證明血清IL-6的夜間濃度在睡眠受損的患者中增加，而IL-6缺乏的小鼠在與做夢相關的快速眼動期中所用時間更長[21]。IL-6、C反應蛋白(CRP)、NF-κB信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等均為炎癥因子，研究發現失眠的發生與炎癥增加有著密切的關聯。通過查閱大量研究發現，較高的CRP水平與睡眠時間長短呈負相關[22]；NF-κB信號通路在慢性失眠焦慮抑郁患者過度炎癥激活中起關鍵作用[23]。研究表明大腦區域FOS的表達與睡眠-覺醒周期節律有關，并且與快速動眼期持續時間呈正相關[24]。

綜上所述，本研究分析發現黃連溫膽湯的藥物歸經具有脾、胃、心經的重點選擇性，槲皮素、川陳皮素、柚皮苷、木犀草素、黃芩苷等黃酮類化合物可通過抗炎、抗氧化的作用，對神經遞質進行調節；黃連溫膽湯治療失眠的關鍵基因靶點為IL-6、CCND1、VEGFA、ICAM1、FOS等，主要作用于核受體活性、神經遞質結合通路、NF-κB信號通路、胃癌信號通路等生物過程，所受作用的關鍵基因靶點與信號通路可重點作用與胃及神經遞質，且含有較多的炎癥因子。因此，黃連溫膽湯治療失眠的作用機制可能為黃酮類化合物及炎癥因子的抗炎作用。雖然，網絡藥理學可以從整體角度科學的解釋中藥的有效性，但存在數據庫中化合物不全面等問題[25]，仍需要后續基礎試驗和臨床試驗的進一步驗證。