基于高通量測序技術探究加味二陳湯對肥胖大鼠腸道微生物組的影響

杜 恒

（武漢市中西醫結合醫院兒科，武漢 430022）

隨著人類工業文明發展，人們生活水平提高，兒童肥胖率呈逐年上升趨勢。據相關研究表明，2014年我國7～18歲兒童肥胖與超重總檢出率高達19.4%。肥胖會引起兒童心血管系統、呼吸系統等多個系統疾病，還會對兒童心理、骨骼以及肝臟等產生影響[1-3]。據相關實驗表明，阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征等也與肥胖有著密不可分的聯系[4-5]。鑒于單純性肥胖對我國兒童健康的巨大威脅，且西藥減肥藥存在的對兒童健康的未知影響，本課題組從5年前開始針對中藥減肥展開了一系列的研究。加味二陳湯為研究成果之一，是武漢市中西醫結合醫院兒科徐輝甫主任醫師的經驗方，其主要功效是運脾和胃，燥濕化痰，可治療以痰濁中阻為主要證候的單純性肥胖。本實驗借助小窩喂養誘導肥胖幼鼠模型，對其進行加味二陳湯灌胃，實驗結果表明，治療后小窩喂養肥胖幼鼠體質量、Lee’s 指數、膽固醇、三酰甘油及游離脂肪酸等指標具有明顯改變[6-7]。本文通過高通量測序技術，進一步研究加味二陳湯對肥胖大鼠腸道微生物組的影響，從分子生物學水平分析治療小兒單純性肥胖采用加味二陳湯的應用價值。

1 材料和方法

1.1 肥胖大鼠模型建立及分組

從湖北實驗動物研究中心購買成年SPF級SD大鼠雌性10只，雄性5只（根據2:1比例使其交配并自然分娩）。將出生后的雄性大鼠分為大窩組與小窩組，其中大窩組每只母鼠哺乳10只雄鼠，小窩組每只母鼠哺乳3只雄鼠。給予哺乳母鼠常規飲食，并在大鼠出生21 d后斷奶，將小窩喂養后的肥胖幼鼠（體質量≥大窩組體質量均值+1.4倍標準差）隨機分成2組：加味二陳湯組（予加味二陳湯灌胃）與對照組（予生理鹽水灌胃），均以標準飼料喂養。

1.2 藥物

治療組方：法半夏、蒼術、生山楂、茯苓、決明子、陳皮、甘草，由四川新綠色藥業科技發展有限公司提供中藥顆粒劑。

1.3 給藥方法

參照5歲兒童生理體質量確定大鼠灌胃劑量，大鼠劑量與人劑量等效。治療組采用加味二陳湯灌胃，時間為5周，直至處死；對照組采用生理鹽水灌胃，時間為5周，直至處死。

1.4 糞便收集、測序及DNA提取

灌胃后采集大鼠腸道微生物樣品。固定大鼠后，在肛門周圍涂抹75%乙醇刺激其排便。用無菌棉簽涂抹糞便后，放入10 mL無菌EP管中，快速放入干冰箱，-80℃冰箱中保存待后續送實驗室。樣本送到上海美吉生物公司進行抗微生物DNA的提取，PCR擴增細菌的16 s區域后，采用Hiseq 2 500平臺進行高通量測序。

1.5 統計學方法

采用Vsearch算法，將相似性大于97%的序列讀數定為一個OTU（operational taxonomic units）。對于相似度水平的OTU代表序列采用RDPclassifier貝葉斯算法進行分類學比對分分析。2組大鼠腸道微生物組在門（phylum）和屬（genes）水平上的豐度，采用t檢驗評估。以P＜0.05表示差異有統計學意義。最后采用LEfSe分析，比較組間菌群差異，找出各組間差異的微生物種類。

2 結果

2.1 測序原始數據分析

通過高通量測序，2組大鼠共12個樣本，共獲得了340 263條高質量的序列讀數，占總序列的96.86%，序列平均長度為300～500 bp。各組樣本數據分析結果，見表1。

表1 序列數據統計（±s）

表1 序列數據統計（±s）

分組 Raw tags均數 Valid tags均數 Valid tags均數百分比/%對照組 32 273±3 632 23 718±2 689 73.51±2.57加味二陳湯組 43 818±6 000 34 848±5 025 79.15±5.72

2.2 2組大鼠腸道微生物多樣性探究

對照組與加味二陳湯組大鼠腸道菌群多樣性分析結果顯示：1）加味二陳湯灌胃導致大鼠腸道菌群特有的OTU減少。2）對照組的腸道菌群均勻度低于加味二陳湯組，說明加味二陳湯組的腸道菌群物種豐富度較高。3）對照組和加味二陳湯組大鼠Shannon指數相近，但經t檢驗差異無統計學意義（P＞0.05）。4）對照組的Simpson指數高于加味二陳湯組，且t檢驗存在統計學意義（P＜0.05），表明加味二陳湯組腸道菌群生物多樣性高于對照組。5）加味二陳湯組大鼠的Chao1指數較對照組高，數據結果具有統計學意義（P＜0.05），說明加味二陳湯對腸道微生物群落具有改善作用。

2.3 2組大鼠菌群差異探究

通過物種分析，研究對照組和加味二陳湯組大鼠腸道菌群的組成。2組中腸道菌群相對較高的前12門見表2。從表中可以看出，在2組大鼠的糞便樣本中，12個門中有9個門出現。但經t檢驗，大部分門的差異均不具有統計學意義，只有螺旋菌門、柔性菌門2組間差異具有統計學意義。加味二陳湯組大鼠腸道菌群中僅存在疣狀微菌和螺旋菌，其Mean豐度分別為（0.010±0.013）%、（0.010±0.014）%、（0.010±0.005）%。

表2 2組大鼠腸道菌群組成中主要門的相對豐度

研究結果顯示，菌屬水平對照組和治療組大鼠腸道菌群的組成。1）對照組和加味二陳湯組腸道菌群豐度最高的三個門分別是厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門。對照組和加味二陳湯組腸道菌群豐度在細菌在屬水平上的差異，其中對照組菌群排名前3的是毛霉、紫色單孢子菌和乳酸菌。2）加味二陳湯組大鼠中豐度較高的前3種細菌分別為瘤胃菌、毛霉菌和紫色單孢子菌。在細菌屬的分類水平上，2組大鼠的腸道菌群有統計學差異，如瘤胃細菌、螺桿菌、副桿菌、真細菌、布魯氏菌、梭菌等。

2.4 2組大鼠腸道菌群LEfSe差異分析

對照組和加味二陳湯組大鼠腸道微生物的LEfSe多級物種層級樹圖結果顯示：2組之間特定細菌門的差異主要表現在厚壁菌門、變形菌門和柔性膜菌門的豐度上。結合統計學分析，加味二陳湯組大鼠腸道微生物多樣性高于對照組。

3 討論

單純性肥胖是指由于卡路里攝入量超出利用與消耗量，導致脂肪在體內不斷積累，體質量超標，不產生器質性病變的肥胖[8-10]。西醫治療單純性肥胖主要以健康教育、改善生活方式、堅持體育鍛煉、藥物以及手術等方式[11-12]。中醫學認為，兒童單純性肥胖主要與飲食不節有關。《素問·通評》中指出：“甘肥貴人，則膏梁之疾也。”兒童由于暴飲暴食以及忙于學習而忽視體育鍛煉致使肥胖發生[13-14]。《素問宣明正氣論》有“久坐傷氣，久坐傷肉”的描寫，《丹溪治法必要》有“肥人多痰”“肥人多濕”的論述。中醫學認為，飲食不節，脾失健運，運化失施導致小兒肥胖。彭真等[15]研究發現，兒童單純型肥胖主要病機與病理發展轉歸的重要因素與痰濕有關。我院兒科徐輝甫教授在治療兒童單純性肥胖方面以加味二陳湯為經驗方，通過多年臨床驗證，治療效果較好，不易反彈，并且副作用較小。治療組方在二陳湯基礎上加生山楂、決明子、蒼術。二陳湯出自《太平惠民和劑局方》，主要功效是理氣和中、化痰燥濕，屬于治療痰濕證經典方。《丹溪心法附余》指出： “此方半夏豁痰燥濕，橘紅消痰利氣，茯苓降氣滲濕，甘草補脾和中。”加味二陳湯在二陳湯原方的基礎上增加生山楂健胃消脂，降低血清中的膽固醇[16]，增加決明子清肝祛濕，調節體內葡萄糖和脂肪代謝[17]，另加蒼術加強運脾燥濕之功，理氣燥濕化痰治標的同時，運脾健脾截生痰之源兼顧治本。在本課題組的前期研究中，加味二陳湯在改善小窩喂養肥胖幼鼠的血脂代謝，減輕體質量和降低 Lee’s 指數等方面獲得了很好的效果。

腸道內微生物主要依靠動物腸道生活，并幫助寄主完成諸多生理功能[18-19]。腸道具有消化吸收的作用，是人體最大的免疫器官，能夠維持人體正常免疫防御功能。微生物是人體內最復雜、最龐大的微生態系統，人體腸道是其主要生長環境，其本身以及代謝產物除能夠調節人體健康外，還可以溝通膳食與宿主之間的關系。基于此，本研究在分析加味二陳湯的減肥功效時，亦探討加味二陳湯對人體腸道微生物的相關影響。

根據高通量測序結果顯示，加味二陳湯組大鼠腸道微生物多樣性高于對照組，而腸道生物多樣性可協助宿主進行能量吸收與儲存[20]。加味二陳湯可能通過調控腸道微生物組來達到減肥效果。埃希氏菌屬是條件菌，通常情況下不致病，但是如果發生特殊情況，會導致宿主腹痛或者腹瀉[21]。本研究中服用了加味二陳湯大鼠埃希氏菌屬豐度要明顯高于對照組，可見加味二陳湯可通過促進排泄降低體質量。值得注意的是，顫螺菌屬和乳桿菌菌屬都屬于益生菌，在宿主對食物的消化中起著必不可少的作用[22]，加味二陳湯組大鼠腸道中的相對豐度要少于對照組。本研究發現，加味二陳湯的使用導致了肥胖大鼠的腸道微生物多樣性明顯升高，其中一些和食物消化相關的菌屬豐度發生了改變，但是這些改變對于宿主健康的影響是未知的，值得我們更進一步的研究。本課題組未來的探索中，會考慮使用更多的大鼠進行實驗，并且設置空白對照組，使實驗的結果更有說服力。