微波輔助高壓法提取金針菇黃酮的純化及活性測定

王廣慧，于德涵，黎 莉

(綏化學院 食品與制藥工程學院， 黑龍江 綏化 152061)

金針菇(FLammuLinaveLutipes(Fr.)Sing)是我們非常熟悉的一種食用菌。它具有很高的營養價值，富含蛋白質、多糖、黃酮、維生素、礦物質及各種人體所必需的氨基酸等營養成分，尤其是金針菇中的黃酮類物質具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤等作用，可開發為保健食品或動物飼料添加劑[1-5]。大孔樹脂常被用于黃酮類物質的純化，因其具有良好的穩定性、強吸附性以及可以在溫和的條件下重復使用等優點[6]，但目前關于將大孔樹脂用作金針菇黃酮純化介質的研究甚少。本項目組曾在文獻[7]中探討了微波輔助高壓法制備金針菇黃酮的最佳條件，筆者將在此基礎上繼續研究以H103型大孔樹脂作為金針菇黃酮純化介質的工藝條件，并通過抑菌和抗氧化實驗檢測金針菇黃酮的活性，以期為其未來的開發利用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

H103型大孔吸附樹脂(天津浩聚樹脂科技有限公司)；實驗所用各種化學試劑都為國產分析純，購自常州市旭宏化工有限公司；金針菇及所用四種細菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌)均為綏化學院發酵實驗室培養所得。

1.2 儀器

752型分光光度計(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)； YM50FG型立式高壓蒸汽滅菌器(山東博科生物產業有限公司)；WBFY-205型微波化學反應器(上海一科儀器有限公司)。

2 方法

2.1 金針菇黃酮的提取

金針菇黃酮的提取方法及含量測定方法(硝酸鋁-亞硝酸鈉法)均按照文獻[7]中所述步驟進行操作。

2.2 H103型大孔樹脂的預處理

用95%乙醇先將H103型大孔樹脂浸泡24 h，然后反復清洗至液體澄清，再用蒸餾水洗至乙醇味消失。再先后用5%(g·g-1)的鹽酸溶液和4%(g·g-1)的氫氧化鈉溶液各浸泡處理4 h，每次處理后都要用蒸餾水清洗至pH值為中性。

吸附率和解析率的計算公式：

式中：C1代表上樣液中金針菇黃酮的質量濃度(mg·mL-1)，C2代表吸附飽和時流出液中金針菇黃酮的質量濃度，C3代表洗脫液中金針菇黃酮的質量濃度；V1代表吸附飽和時所消耗的上樣液體積(mL)，V2代表吸附飽和時流出的液體體積，V3代表洗脫液體積。

2.3 純化工藝優化[8]

將預處理過的H103型大孔樹脂裝入普通玻璃層析柱(16 mm×240 mm)中，樹脂高度為12 cm，分別考察樣品液的pH、濃度、上樣速度對金針菇黃酮吸附率的影響，以及乙醇的濃度、洗脫速度、用量對黃酮解析率的影響。每組實驗重復三次。

2.4 純化效果檢測

按優化后的最佳條件用H103型大孔樹脂對金針菇黃酮進行純化，然后通過計算金針菇黃酮在解析液及樣品液烘干后物質中所占的比例，求得純化倍數。

2.5 抗菌活性測定[9～12]

采用抑菌圈法進行檢測。

2.5.1 菌懸液的制備 在37℃下，用氣浴恒溫振蕩器以120 r·min-1的轉速連續培養四種活化菌株，并持續關注菌懸液在波長600 nm處的OD值，當其為0.1時停止培養。菌體濃度此時約為1×106～1×107CFU( Colony-Forming Units，菌落形成單位) ·mL-1。

2.5.2 抑菌活性檢測實驗 將四種菌懸液各0.1 mL涂布在LB固體培養基平板上，插入牛津杯(內徑6 mm)，取0.1 mL質量濃度分別為0.10、0.25、0.40、0.55、0.70 mg·mL-1的金針菇黃酮樣品液加入杯中，37℃培養24 h后測量抑菌圈直徑。

2.6 抗氧化實驗[11～14]

2.6.1 清除ABTS·能力檢測 在250 mL容量瓶中加入40.00 mg的ABTS、10 mL的蒸餾水以及8.00 mL的過硫酸鉀(濃度為1.0 mg·mL-1)，室溫避光反應16 h。加蒸餾水32 mL，以無水乙醇定容后靜置10 h備用。

取濃度分別為0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mg·mL-1的金針菇黃酮溶液各0.5 mL，加入1.5 mL 95%乙醇及2 mL配制好的ABTS溶液，反應30 min后測其在734 nm處的光吸收值A1。

將ABTS溶液換成蒸餾水，重復上述步驟，所測吸光值為A2。保留ABTS溶液，以95%乙醇代替黃酮提取物，重復上述步驟，所測吸光值為A0。同時以VC為對照。

2.6.2 清除DPPH·能力檢測 取3.5 mL 的DPPH溶液(濃度為1.0×10-4mol·L-1，以無水乙醇配制而成)與0.5 mL無水乙醇混合，閉光反應30 min，測其在517 nm處的吸光值 A0；

以0.5 mL純化后的金針菇黃酮提取液替代0.5 mL無水乙醇，按上述方法進行操作，測得其吸光值 A1；

以3.5 mL 無水乙醇替代DPPH溶液，同樣加入0.5 mL黃酮提取液，測得其吸光值 A2。所用對照品為VC。

2.6.3 清除OH·能力檢測 在2.0 mL FeSO4溶液(1.8 mmoI·mL-1)中各加入1.0 mL濃度分別為0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mg·mL-1的金針菇黃酮溶液，再加入1.8 mmol·mL-1的水楊酸-乙醇溶液1.5 mL和0.3%(g·mL-1)的過氧化氫溶液 0.1 mL，混合均勻。在37 ℃水浴中靜置30 min后測其在510 nm下的吸光值A1。

將過氧化氫溶液換成蒸餾水，重復上述實驗操作，所測吸光度值為A2。

將黃酮提取液換成蒸餾水，重復上述實驗操作，所測吸光度值為A0。所用對照品依然為VC。

3 結果與分析

3.1 線性回歸方程

實驗所得測定黃酮含量的線性回歸方程為y = 10.273x + 0.001 2, R2= 0.9959。其中y為吸光值，x為黃酮濃度(mg·mL-1)。

3.2 純化工藝優化結果

3.2.1 上樣液pH對吸附率的影響 用5%鹽酸溶液和2%的氫氧化鈉溶液將濃度為1.45 mg·mL-1的金針菇黃酮樣品液pH調為3、4、5、6、7，以0.3 mL·min-1的流速進行吸附，然后計算飽和吸附率(飽和吸附點的判定標準為：流出液中黃酮濃度約為其上樣液中初始濃度的十分之一)。

實驗結果見圖1。

圖1 上樣液pH對吸附率的影響

由圖1可知，在所測定的樣品液pH范圍內，當樣品液的pH大于5.0時，黃酮吸附率隨樣品液pH的增大而減小；當樣品液的pH在3.0～5.0范圍內，吸附率呈上升趨勢；當樣品液pH為5.0時，黃酮吸附率達到最大值。分析原因可能是金針菇黃酮屬于多羥基酚類化合物，只有在適當酸性條件下能夠形成氫鍵，利于大孔吸附樹脂吸附。當酸性太強時，黃酮分子內的氧原子易質子化，不易被吸附；而在堿性條件下黃酮分子中形成酚氧負離子，影響氫鍵的形成，也會導致吸附率下降。

3.2.2 上樣液濃度對吸附率的影響 考察時所設定的吸附條件是：pH5的樣品液，吸附速率為0.3 mL·min-1，樣品液濃度分別為0.85、1.15、1.45、1.75、2.05 mg·mL-1。實驗結果見圖2。

圖2 上樣液濃度對吸附率的影響

由圖2可知，在所測量的上樣液濃度范圍內，在0.85～1.45 mg·mL-1時，吸附率逐漸增加；當濃度大于1.45 mg·mL-1時，吸附率隨濃度的增加而降低。因此選擇1.45 mg·mL-1作為上樣液最適濃度。

3.2.3 上樣液流速對吸附率的影響 考察時所設定的吸附條件是：樣品液pH為5，上樣液濃度為1.45 mg·mL-1，流速分別為0.30、0.55、0.80、1.05、1.30 mL·min-1。

實驗結果見圖3。

圖3 上樣液流速對吸附率的影響

由圖3可知，吸附率隨上樣液流速逐漸加快而逐漸降低，說明較慢的上樣速度利于樹脂對黃酮的吸附，但流速太慢勢必會使吸附時間過長，綜合考慮工作效率問題，選擇0.30 mL·min-1為最佳流速。

3.2.4 洗脫劑濃度對解析率的影響 先用蒸餾水反復沖洗已飽和吸附有金針菇黃酮的H103型大孔吸附樹脂層析柱，直至流出的液體無色，再用60 mL乙醇以2 mL·min-1的速率進行洗脫，乙醇濃度分別設為50%、60%、70%、80%、90%。計算黃酮解析率。

實驗結果見圖4。

圖4 洗脫劑濃度對解析率的影響

由圖4可知，最佳洗脫劑濃度為70%，乙醇體積分數過大或過小都不利于黃酮的洗脫。

3.2.5 洗脫速率對解析率的影響 設定洗脫速率分別為2、2.5、3、3.5、4 mL·min-1，洗脫劑乙醇的濃度采用70%，乙醇用量采用60 mL，在此條件下分析黃酮解析率。

實驗結果見圖5。

圖5 洗脫速率對解析率的影響

由圖5可知，洗脫速率越小越有利于洗脫，原因可能是速率小時可使乙醇與樹脂充分接觸，宜于黃酮的洗脫，但速率過小會過分延長洗脫時間，因此綜合考慮工作效率，選擇2 mL·min-1為最佳洗脫速率。

3.2.6 洗脫劑用量對解析率的影響 用70%乙醇以2 mL·min-1進行洗脫，洗脫劑用量分別設為10、20、30、40、50、60 mL，計算黃酮解析率。

實驗結果見圖6。

圖6 洗脫劑用量對解析率的影響

由圖6可知， 60 mL 70%乙醇可將大孔樹脂上吸附的金針菇黃酮徹底洗脫。

3.3 純化效果檢測

檢測結果見表1。

表1 純化效果檢測結果

由此表可見，純化倍數可達3.27倍，說明用此工藝純化金針菇黃酮能取得比較好的效果。

3.4 抗菌實驗

測量3組平行實驗所獲得的抑菌圈直徑，取平均值后所得數據見表2。

表2中數據表明，在所測量的0.10～0.70 mg·mL-1濃度范圍內，金針菇黃酮對四種菌株都表現出一定程度的抗菌活性，且總體趨勢是黃酮濃度越大，抗菌活性越強，其對四個菌種抗性順序為：大腸桿菌最強，沙門氏菌次之，金黃色葡萄球菌第三，枯草芽孢桿菌最弱。

表2 黃酮濃度對菌種抑菌圈直徑的影響

3.5 抗氧化實驗

3.5.1 清除ABTS·能力檢測結果 金針菇黃酮和VC清除ABTS·能力比較見圖7。

圖7表明，金針菇黃酮對ABTS·有一定的清除能力，并且黃酮濃度越高，對ABTS·的清除能力也越強，但與相同濃度的VC相比，金針菇黃酮對ABTS·的清除率低于VC。

3.5.2 清除DPPH·能力檢測結果 金針菇黃酮和VC清除DPPH·能力比較見圖8。

圖8 黃酮和Vc清除DPPH·能力比較

圖8表明，金針菇黃酮和VC對DPPH·都有清除能力，并且隨著濃度升高，二者對 DPPH·的清除作用也越強，但相對于VC，金針菇黃酮的清除率上升幅度不是很明顯，且在相同濃度時，金針菇黃酮清除DPPH·的能力弱于VC。

3.5.3 清除OH·能力檢測結果 金針菇黃酮和VC清除OH·能力比較見圖9。

圖9表明，金針菇黃酮和VC對OH·都具有一定的清除能力，并且二者對OH·的清除能力與濃度呈正相關，但在相同濃度下，金針菇黃酮對OH·的清除能力不如VC強。

圖9 黃酮和Vc清除OH·能力比較

4 結 論

對利用微波輔助高壓法制取的金針菇黃酮的生物活性進行了檢測，并對H103型大孔樹脂作為金針菇黃酮純化介質的最適條件進行了探討。由研究結果可以做出以下結論：

(1)H103型大孔樹脂純化金針菇黃酮的效果很好，其最優純化條件為：采用濃度為1.45 mg·mL-1、pH值為5的上樣液以0.30 mL·min-1的流速進行吸附；采用體積分數為70%的乙醇60 mL以2 mL·min-1的流速進行洗脫。按此純化條件得到的黃酮純度可達到純化前的3.27倍。

(2)抗菌性研究顯示：金針菇黃酮對四種實驗用菌都有一定的抑制作用，抑菌效果與金針菇黃酮濃度呈正相關。對四種菌株抗菌能力由強至弱順序為: 大腸桿菌，沙門氏菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌。

(3)氧化抗性實驗結果表明：金針菇黃酮具有一定的氧化抗性，能有效消除ABTS·、DPPH·和OH·，并且隨著濃度的增加，其抗氧化活性也在增強，但低于同濃度下的VC。

由此可見，利用微波輔助高壓法提取金針菇黃酮不但可獲得較高的提取率[13]，且能保留黃酮的抑菌性和抗氧化性；使用H103型大孔樹脂能對金針菇黃酮起到很好的純化作用。這為金針菇黃酮產品的開發提供了依據。