甘藍型油菜-蘿卜C染色體附加系與普通白菜雜交F1的SSR標記鑒定

丁云花 Holger Budahn 趙 泓 趙岫云*

（1 北京市農林科學院蔬菜研究中心，農業農村部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，蔬菜種質改良北京市重點實驗室，北京 100097；2 德國JKI 栽培植物聯邦研究中心園藝作物育種研究所，Quedlinburg D-06484）

蘿卜（Raphanus）與蕓薹（Brassica）是十字花科中兩個非常重要的近緣屬。早在1924年Karpechenko 就開始進行蘿卜和蕓薹之間的雜交試驗，以創造新的物種或實現基因漸滲（Karpechenko，1924）。迄今，蘿卜中已有多個有益基因通過蘿卜與蕓薹屬作物之間的雜交而導入到蕓薹屬作物中，如細胞質雄性不育基因和細胞核育性恢復基因（Bannerot et al.，1974，1977；Heyn，1976；Budar & Pelletier，2001）、抗TuMV基因（Kr?mer et al.，2003）、抗甜菜根結線蟲基因（Clauss，1978；Peterka et al.，2004）等。在前人研究基礎上，Budahn 等（2008）通過蘿卜附加系與甘藍型油菜回交開發了一整套甘藍型油菜-蘿卜附加系，并利用染色體附加系定位了1 個抗甜菜胞囊線蟲的QTL 位點（Budahn et al.，2009）。

利用甘藍型油菜-蘿卜附加系與白菜類作物進行回交，可將蘿卜染色體導入白菜類作物，創制具有蘿卜優異性狀的白菜類新種質。而在回交后代中，能否高效選擇附加蘿卜染色體的目標材料將直接影響新種質創制的效率。利用分子標記技術可以在苗期進行目標基因型的高效選擇。本試驗利用一套已知蘿卜染色體組成的甘藍型油菜-蘿卜附加系標準材料，參考Nakatsuji 等（2011）和Hashida 等（2013）構建的蘿卜C 染色體錨定標記的連鎖圖譜，建立能夠準確鑒定甘藍型油菜-蘿卜C 染色體附加系與普通白菜雜交后代中外源蘿卜C 染色體的特異SSR 標記，以期應用于將蘿卜C 染色體導入白菜基因組的回交過程中目標材料的高效選擇。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試材料均由北京市農林科學院蔬菜研究中心提供。一套包含21 個已知蘿卜染色體組成的標準材料，包括蘿卜親本A24/2 和A107/1（兩者均含蘿卜9 對染色體A～I），甘藍型油菜親本A3/1 和A246/1（兩者均不含蘿卜染色體），一套甘藍型油菜-蘿卜多體附加系14/52（附加蘿卜染色體B、D 和G）、14/15-66（附加蘿卜染色體A、E 和I）、14/32（附加蘿卜染色體C 和F）、14/53（附加蘿卜染色體D）、14/35（附加蘿卜染色體B、C、F、H和I）、14/37（附加蘿卜染色體B 和H）、14/45（附加蘿卜染色體B、C、E 和G）、14/15-61（附加蘿卜染色體A、E 和I），一整套甘藍型油菜-蘿卜二體附加系AA（含蘿卜染色體A）、BB（含蘿卜染色體B）、CC（含蘿卜染色體C）、DD（含蘿卜染色體D）、EE（含蘿卜染色體E）、FF（含蘿卜染色體F）、GG（含蘿卜染色體G）、HH（含蘿卜染色體H）、II（含蘿卜染色體I）；普通白菜品種559（不含蘿卜染色體C）、甘藍型油菜-蘿卜C 染色體附加系CC 與普通白菜559 雜交獲得的F1。

2017 年9 月15 日在北京市農林科學院蔬菜研究中心農場日光溫室種植所有材料，分別播種于50 孔穴盤，每穴1 粒；F1播種10 穴，其余材料均播種5 穴。出苗30 d 后取完全展開的心葉用于提取DNA。

1.2 試驗方法

DNA 提取采用SDS 法（李麗和鄭曉鷹，2003），濃度調整至8 ng·μL-1。

蘿卜染色體C 的SSR 引物：參考Nakatsuji 等（2011）和Hashida 等（2013）構建的蘿卜染色體定位連鎖圖譜，選擇定位于蘿卜C 染色體連鎖群的2 條SSR 標記引物，引物序列見表1。

表1 SSR 引物序列

PCR反應體系（6 μL）：10× Buffer 0.6 μL，MgCl2（50 mmol·L-1）0.3 μL，dNTPs（12.5 mmol ·L-1）0.12 μL，Taq酶（5 U·μL-1）0.12 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.3 μL，DNA（8 ng ·μL-1）1.6 μL，ddH2O 2.66 μL。PCR 擴增程序：94℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環；72 ℃延伸7 min；10℃保存。PCR 擴增產物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳在自動測序儀LI-COR 4300 上分離檢測。

熒光原位雜交鑒定：利用蘿卜基因組特異探針pURsN 檢測甘藍型油菜-蘿卜C 染色體附加系CC 與普通白菜559 雜交F1的遺傳背景中是否含有蘿卜基因組。其中，蘿卜基因組特異探針pURsN的制備參考Hirai 等（1995）的方法，酶解和制片參考趙泓等（2014）的方法，熒光原位雜交參考Schrader 等（2000）的方法。

2 結果與分析

2.1 外源蘿卜C 染色體SSR 標記的建立

根據21 個甘藍型油菜-蘿卜附加系標準材料已知所含染色體的情況，可列出各標準材料中所含蘿卜C 染色體的信息（表2）。

利用2對SSR引物RsSA078 和RH148分別對21 個甘藍型油菜-蘿卜附加系標準材料的DNA進行PCR 擴增。從圖1 可以看出，RsSA078 和RH148 的擴增結果一致，均在A24/2、A107/1、14/32、14/35、14/45 和CC 中擴增出了特異片段，片段大小分別為170 bp 和190 bp，而其他15 份材料沒有擴增出相應條帶。該結果與表2 所列的21 個甘藍型油菜-蘿卜附加系標準材料所含蘿卜C 染色體的信息一致，說明這2 個SSR 引物標記RsSA078-170 和RH148-190 均為蘿卜C 染色體的特異標記。

圖1 引物RsSA078 和RH148 對21 個甘藍型油菜-蘿卜附加系標準材料的SSR 擴增結果

表2 21 個甘藍型油菜-蘿卜附加系標準材料中蘿卜C 染色體的信息

2.2 利用SSR 特異標記鑒定F1 外源蘿卜C 染色體

利用上述建立的蘿卜C 染色體的SSR 特異標記RsSA078-170 和RH148-190 對甘藍型油菜-蘿卜C 染色體附加系CC、普通白菜559 及其雜交F1進行外源蘿卜C 染色體的鑒定與篩選。從圖2 可以看出，2 對SSR 引物RsSA078 和RH148 的PCR 擴增結果一致，甘藍型油菜-蘿卜C 染色體附加系CC 的4 個單株和10 個F1單株均擴增出大小為170 bp 和190 bp 的特異片段，而普通白菜559 沒有擴增出相應的特異片段。說明甘藍型油菜-蘿卜C 染色體附加系CC 與普通白菜559 雜交后10 個F1單株均含有蘿卜C 染色體。

圖2 F1 外源蘿卜C 染色體的SSR 特異標記鑒定結果

2.3 利用熒光原位雜交技術檢測F1 蘿卜基因組

利用蘿卜基因組特異探針pURsN 分別與親本甘藍型油菜-蘿卜C 染色體附加系CC、普通白菜559 及其雜交F1的基因組進行熒光原位雜交鑒定。結果顯示（圖3），甘藍型油菜-蘿卜C 染色體附加系CC 和F1有綠色雜交信號，而普通白菜559 沒有雜交信號，說明甘藍型油菜-蘿卜C 染色體附加系CC 和F1含有蘿卜基因組，普通白菜559 不含蘿卜基因組。

圖3 蘿卜基因組特異探針pURsN 對F1 基因組的熒光原位雜交檢測結果

3 結論與討論

對于屬（種）間雜種的鑒定，除了傳統的形態學、細胞學和同工酶方法之外，還有現代分子標記和原位雜交等方法。利用傳統形態學和細胞學方法雖然也能對目標材料進行選擇，但是選擇效率低，尤其是對數量性狀或更復雜的多性狀選擇，其選擇效率和準確率就更低了。現代分子生物技術的快速發展，為復雜的多性狀在DNA 水平進行早期、準確、高效地選擇提供了可能。SSR 分子標記是以1～6 個核苷酸為基本單位的串聯重復序列，廣泛存在于基因組中，為共顯性遺傳，重復性好，被廣泛應用于遺傳連鎖圖譜的構建、分子標記輔助選擇、作物遺傳多樣性的研究、基因挖掘、品種純度鑒定等植物種質資源和育種領域（張增翠和侯喜林，2004；Iniguez-Luy et al.，2008；顧愛俠 等，2009；鞏紅影 等，2014；王娟 等，2017；賴瑞強 等，2018；張潤霖 等，2020；朱志成，2021）。

本試驗參考Nakatsuji 等（2011）和Hashida 等（2013）構建的蘿卜C 染色體錨定標記的連鎖圖譜，利用21 個已知蘿卜染色體組成的標準材料確定了2 個甘藍型油菜-蘿卜附加系中外源蘿卜C染色體的特異SSR 標記RsSA078-170 和RH148-190。應用這2 個標記對甘藍型油菜-蘿卜C 染色體附加系CC 與普通白菜559 雜交所得的F1進行外源蘿卜C 染色體鑒定，結果表明10 個F1單株均附加了蘿卜C 染色體，說明通過雜交可以將蘿卜C 染色體從甘藍型油菜-蘿卜C 染色體附加系CC 導入普通白菜中。同時，利用蘿卜基因組特異探針pURsN 對F1的基因組進行熒光原位雜交檢測，結果表明F1含有蘿卜基因組，該結果驗證了2個SSR 標記RsSA078-170 和RH148-190 的鑒定結果是準確的。說明SSR 特異標記RsSA078-170 和RH148-190 可以用于甘藍型油菜-蘿卜C 染色體附加系與普通白菜559 雜交后代中外源蘿卜C 染色體的鑒定。