設施菜地種植年限對土壤氨氧化微生物豐度和群落結構的影響

趙 輝 王喜英 盧志宏 譚智勇

（銅仁學院經濟管理學院，貴州銅仁 554300）

設施蔬菜是現代農業集約化發展的一個重要分支，具有集約化程度高、收益大等特點，在許多地區已經成為支柱產業（王學霞 等，2018）。截止到2018 年，我國設施蔬菜面積達到了400 萬hm2（6 000萬畝）左右，位居世界第一，占蔬菜種植總面積的19.1%（王學霞 等，2021）。然而，設施蔬菜具有種植指數高、農業投入（如殺菌劑、化肥、塑料薄膜）大、封閉或半封閉環境導致棚內溫濕度較高且無雨水淋溶等特點。因此，設施蔬菜長期種植已經引起了人們對土壤質量退化、土壤和蔬菜潛在污染以及對人類健康的負面影響的擔憂（寧德富 等，2016；Sun et al.，2016）。氮（N）是作物生長的主要限制因子，土壤氮有效性在決定作物氮素吸收和產量方面起著重要作用（李生秀，2008）。鑒于氮素對作物生長的顯著貢獻，設施栽培中大量氮肥被施入土壤，氮肥大量施用雖然提高了設施蔬菜的產量，但也造成了土壤養分氮的大量積累，加劇了土壤次生鹽漬化和酸化，導致病原菌不斷積累，土壤質量逐漸退化，溫室氣體排放加劇等問題，蔬菜品質下降，嚴重制約了設施蔬菜高效可持續發展（王倩姿，2019）。

硝化作用是自然界土壤氮素循環中的一個重要環節，土壤氨態氮在微生物作用下轉化為亞硝酸鹽氮（）和硝酸鹽氮（）的過程，同時連接固氮作用、氨化作用和反硝化作用，直接影響氮素利用和環境質量（Vitousek et al.，1997）。硝化過程可以分為兩步完成，第一步為氨態氮在亞硝化微生物下氧化成亞硝酸鹽氮（）的過程，也稱為氨氧化過程；第二步為亞硝酸鹽氮在亞硝酸鹽氧化酶下氧化為硝酸鹽氮（）。在硝化過程中，亞硝態氮不穩定，易被氧化為硝態氮；因此，氨氧化過程的限速步驟，主要由氨氧化細菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）催化完成。研究表明，土壤pH、水分、有機質含量、施氮量和土地利用方式等對AOB、AOA 數量和群落結構有影響（Chen et al.，2014；Zhong et al.，2016）。可知，隨著設施蔬菜種植年限的延長，土壤理化性質的變化將不可避免地導致硝化微生物數量和群落結構發生變化（方明 等，2019）。

前人研究認為，在氮充足的草地和農田生態系統中，硝化作用主要由AOB 驅動（Di et al.，2009；Jia & Conrad，2009）。Gubry-Rangin 等（2010）研究認為，在酸性低營養農田土壤中，硝化作用主要由AOA 驅動。Zhong 等（2016）研究表明，設施蔬菜土壤中AOB 和AOA 數量隨施氮量增加呈現下降趨勢，且AOB 群落結構變化較大。然而，關于設施蔬菜長期種植對土壤硝化微生物數量和群落結構的研究鮮見報道。

為此，本試驗運用Illumina MiSeq 高通量測序技術和熒光定量PCR 技術對不同種植年限設施菜地土壤硝化微生物數量和群落結構進行研究，以揭示硝化微生物群落結構和豐度隨設施種植年限的變化規律及其主要驅動環境因子，從硝化微生物的角度來解析土壤氮素利用效率，定向調控土壤氮素轉化過程，為實現設施栽培蔬菜產業的可持續發展提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

試驗在貴州省銅仁市碧江區和平鄉農業園區（109°07′44″E，27°46′46″N）進行。試驗點屬于亞熱帶季風氣候，年均溫18 ℃，年降水量1 313 mm，土壤類型為黃壤。

1.2 試驗設計

2017 年7 月在和平鄉農業園區日光溫室基地選取種植年限分別為3、5、7 a 的設施蔬菜大棚各3 個，大棚長40 m，寬8 m，以周圍種植的露地蔬菜為對照（CK）。每個設施種植年限設置3 個重復，即每個大棚為1 個重復，露地蔬菜（CK）也設置3個重復。設施大棚每年蔬菜種植類型一致，輪作茄子、黃瓜、西葫蘆、豇豆等，每年種植2 茬。設施蔬菜基肥長期施用氮磷鉀復合肥1 200～1 500 kg ·hm-2，追施氮肥600～750 kg·hm-2。露地蔬菜主要種植茄子、南瓜、豇豆等，長期施用氮磷鉀復合肥600～750 kg·hm-2，追施氮肥300～450 kg·hm-2。在整個試驗處理中，除種植年限差異外，其余生產管理措施一致。

1.3 土樣采集

在各樣地內按“S”形（5 點法）采集0～10 cm 土層土壤樣品，混合成1 個土樣，用低溫冰盒保存并迅速帶回實驗室。土樣在室內去除石塊和植物根系并過2 mm 篩后，分為2 份，一份-80 ℃冰箱保存，用于amoA基因群落結構和豐度分析；一份新鮮土壤用于銨態氮和硝態氮含量測定，余下部分室內風干過篩用于土壤化學指標測定。

1.4 測定項目

1.4.1 土壤化學指標測定 土壤化學性質采用鮑士旦（2000）的方法進行測定：土壤pH 值采用電位法測定，有機碳（SOC）含量采用重鉻酸鉀氧化法測定，全氮（TN）含量采用凱氏定氮法測定，銨態氮含量采用靛酚藍比色法測定，硝態氮含量采用酚二磺酸比色法測定。

1.4.2 土壤DNA 提取及熒光定量PCR 稱取0.5 g 土壤，按照E.Z.N.A.?Soil DNA Kit（Omega，GA，USA）試劑盒操作步驟提取土壤DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的完整性，用核酸定量儀（Nanodrop-NC2000）檢測DNA 濃度和純度。PCR 產物純化回收后，將其連接至pMD18-T 載體，轉化至大腸桿菌DH5α 感受態中進行培養，篩選陽性克隆，提取amoA基因重組質粒，質粒濃度經核酸定量儀測定后，計算基因拷貝數，按照10倍梯度稀釋至103～108拷貝數，制備標準曲線。熒光定量PCR 反應在ABI7500 熒光定量PCR 儀上進行，反應體系為20 μL：10 μL 2×SYBR Green，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，ROX 0.5 μL，DNA 模板2 μL（1～10 ng），最后用ddH2O補至20 μL。熒光定量PCR 反應條件為：95 ℃ 30 s；95℃ 5 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，40 個循環。

1.4.3 高通量測定 AOA 擴增引物為amoA-23F（5′-ATGGTCTGGYTWAGACG-3′）和amoA-616R（5′-GCCATCCATCTGTATGTCCA-3′）。AOB 擴增引物為amoA-1F（5′-GGGGTTTCTACTGGTGG T-3′）、amoA-2R（5′-CCCCTCKGSAAAGC CTTCTTC-3′）（Wessén et al.，2011）。PCR體系25 μL：5×Ex Taq緩沖液5.0 μL，dNTP（2.5 μmol ·L-1）2.0 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1.0 μL，DNA 模 板2.0 μL（1～10 ng），Ex Taq（5 U ·μL-1）0.25 μL，最后用ddH2O 補至25 μL。PCR 反應條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72℃ 1 min，27 個循環；72 ℃ 10 min。以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物。樣品送至上海派森諾生物科技股份有限公司，運用Illumina MiSeq 測序平臺進行測序。測序樣品數據下機后，根據barcode標簽序列和前引物序列篩選出有效序列，去除接頭和barcode 序列，利用FLASH 軟件對通過質量初篩的雙端序列根據重疊堿基進行配對連接，同時利用USEARCH 軟件檢查并剔除嵌合體序列，從而獲得高質量有效序列。使用QIIME 軟件調用UCLUST 序列比對工具，按照97%的序列相似度進行OTU（Operational Taxonomic Unit）劃分和歸并，并選取豐度最高的序列作為該OTU 的代表序列。利用QIIME 軟件將OTU 的代表序列與功能基因數據庫（FunGene）進行比對，獲取每個OTU 對應的分類學信息。

1.5 數據處理

采用SPSS 21.0 軟件進行土壤化學性質、氨氧化微生物α 多樣性指數、豐度和群落組成相對豐度的差異顯著性分析（P＜0.05）和相關性分析。采用R 軟件進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和冗余分析（redundancy analysis，RDA）。

2 結果與分析

2.1 種植年限對土壤化學性質的影響

由表1 可知，設施蔬菜長期種植對土壤理化性質有顯著影響（P＜0.05）。不同設施菜地種植年限土壤pH 值、有機碳含量和碳氮比均顯著小于CK，且隨種植年限延長逐漸降低。種植3、5、7 a土壤全氮、銨態氮和硝態氮含量均高于CK，且隨種植年限延長逐漸增加。由此可知，設施蔬菜長期種植土壤酸性增強，土壤銨態氮和硝態氮含量積累。

表1 不同種植年限設施菜地土壤理化性質

2.2 種植年限對氨氧化菌amoA 基因豐度的影響

由圖1 可知，不同設施菜地種植年限土壤AOA-amoA和AOB-amoA基因拷貝數變化范圍分別為2.02 × 107～3.28 × 107個·g-1（干土）和0.53 ×106～1.91 × 106個·g-1（干土）。AOA-amoA拷貝數隨種植年限延長逐漸下降，種植3 a 和5 a 處理土壤AOA-amoA拷貝數均顯著高于7 a 和CK（P＜0.05），其中種植3 a 和5 a 處理之間差異不顯著；種植7 a 土壤AOA-amoA拷貝數低于CK，但差異不顯著（P＞0.05）。AOA-amoA和AOB-amoA拷貝數在各處理中變化趨勢相同，且AOA-amoA拷貝數在不同處理中均高于AOB-amoA。AOA/AOB值為17.33～39.16，大小順序表現為CK ＞7 a ＞5 a ＞3 a，且7 a 處理分別與3 a 和5 a 處理間差異顯著（P＜0.05）。

圖1 不同種植年限設施土壤AOA-amoA 和AOB-amoA 基因豐度及AOA/AOB

2.3 種植年限對氨氧化微生物α 多樣性的影響

種植年限對AOA 群落的Chao1 指數、ACE指數和Simpson 指數有極顯著影響（P＜0.01）；對Shannon 指數有顯著影響（P＜0.05）（表2）。Chao1 指數和ACE 指數范圍分別為97.65～221.13和98.80～228.65，其中種植3 a 處理顯著高于其他處理。Shannon 指數和Simpson 指數范圍為2.87～4.26 和0.83～0.94，大小順序為3 a ＞5 a ＞CK ＞7 a（表3）。

種植年限對AOB 群落的ACE 指數和Simpson指數有顯著影響（P＜0.05）（表2）。Chao1 指數 和ACE指數范圍分別為192.15～415.53 和195.63～424.68，其中3 a 和5 a 處理分別是CK 的2.16、2.03 倍和2.17、2.04 倍。Shannon 指數范圍為3.38～4.60，3 a 和5 a 處理分別是CK 的1.11 倍和1.08 倍。Simpson 指數范圍為0.68～0.88，大小順序為5 a ＞CK ＞3 a ＞7 a，7 a 分別與CK、3 a和5 a 處理間差異顯著（表3）。

表2 設施栽培年限對AOA 和AOB 多樣性指數的影響方差分析

表3 不同種植年限設施土壤AOA 和AOB 群落ɑ 多樣性指數的影響

2.4 種植年限對AOA 和AOB 群落的影響

在門水平上，AOA 群落由奇古菌門（Thaumarchaeota）、變形菌門（Proteobacteria）、unidentified 組成（圖2-A）。奇古菌門為主要優勢類群，各處理相對豐度分別為55.03%～71.90%；其中種植3 a 處理相對豐度為55.06%，極顯著低于其他處理。變形菌門相對豐度為6.36%～24.26%；其中種植3 a 處理最高，隨設施種植年限延長逐漸減低，且處理間差異顯著。在屬水平上，共檢測到6個類群（圖2-B），分別為Candidatus Nitrosotalea、亞硝化暖菌屬（Nitrososphaera）、亞硝化單胞菌（Nitrosomonas）、Archaea-unidentified、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）和氣單胞菌屬（Aeromonas）。其中Candidatus Nitrosotalea、亞硝化暖菌屬和亞硝化單胞菌屬為優勢類群，各處理相對豐度分 別 為30.23%～58.76%、12.12%～33.54% 和3.68%～18.91%。Candidatus Nitrosotalea相對豐度大小順序為CK ＞5 a ＞3 a ＞7 a，說明設施年限延長對其有抑制作用。亞硝化暖菌屬、亞硝化單胞菌屬相對豐度在3、5 a 和7 a 處理中均顯著高于CK，說明設施栽培對其有促進作用。硝化螺旋菌屬在5 a 處理中相對豐度為5.33%，高于其他處理，但各處理間差異不顯著。Archaea-unidentified在CK 中相對豐度為11.48%，高于其他處理。氣單胞菌屬在5 a 處理中相對豐度最低，但與其他處理間差異不顯著。

圖2 設施種植年限土壤氨氧化古菌門和屬水平組成

AOB 群落在門水平上共獲得3 個類群（圖3-A），分別為變形菌門（Proteobacteria）、奇古菌門（Thaumarchaeota）和硝化螺旋菌門（Nitrospirae）。變形菌門為主要優勢類群，相對豐度范圍為73.57%～87.55%，3 a 和5 a 處理分別是CK 的1.12倍和1.03 倍。奇古菌門相對豐度在CK 中最低，隨設施種植年限延長呈先增加后降低趨勢。硝化螺旋菌門相對豐度在CK 最高，隨設施種植年限延長表現出先降低后增加趨勢。在屬水平上，共檢測到5 個類群（圖3-B），分別為亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）、Candidatus Nitrosotalea、亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）和亞硝化暖菌屬（Nitrososphaer）。亞硝化螺菌屬為優勢類群，相對豐度范圍為77.21%～86.55%。亞硝化螺菌屬的相對豐度在3 a 和5 a 處理中較高，分別是CK 的1.10 倍和1.05 倍，隨設施種植年限延長逐漸降低。Candidatus Nitrosotalea相對豐度在7 a 處理中最低，顯著低于其他處理。亞硝化單胞菌屬和硝化螺旋菌屬相對豐度在CK 中最高。亞硝化暖菌屬相對豐度在3 a 處理最高，隨設施種植年限延長表現出先減少后增加的趨勢。

圖3 不同種植年限設施土壤氨氧化細菌門和屬水平組成

2.5 氨氧化微生物群落結構及其與土壤化學性質的關系

通過對AOA 和AOB 群落進行主成分分析可知（圖4），不同設施種植年限土壤AOA 和AOB群落結構差異明顯。AOA 的PC1 和PC2 分別為56.79%和18.60%，二者累計貢獻率達到75.39%。3、5 a 和7 a 處理分別與CK 在PC1 和PC2 上分離都較大，說明設施蔬菜種植年限導致AOA 群落結構變化較大；3 a 和7 a 處理相聚較近，群落相似度較大。AOB 的PC1 和PC2 分別為55.30%和27.38%。3、5 a 和7 a 處理在PC1 和PC2 上分離都較大，說明設施蔬菜種植年限對AOB 群落結構影響較大。總體看來，種植年限對AOA 群落的影響強于AOB。

圖4 不同種植年限設施土壤AOA 和AOB 群落主成分分析

RDA 反應基于屬分類水平上土壤化學性質對AOA 和AOB 群落結構的影響（圖5）。AOA 的RDA1 和RDA2 軸分別為61.29%和19.59%。土壤pH 對AOA 群落結構有顯著影響（P＜0.05），銨態氮和硝態氮對AOA 群落結構有極顯著影響（P＜0.01）。AOB 的RDA1 和RDA2 軸 分 別 為39.64%和25.24%。土壤銨態氮和硝態氮對AOB群落結構有顯著影響（P＜0.05）。

圖5 AOA、AOB 與土壤化學性質的冗余分析

3 討論

3.1 種植年限對設施土壤AOA 和AOB 數量的影響

AOA 和AOB 是氨氧化作用的主要承擔者，在土壤氮轉化過程中具有重要作用，影響植物對氮素的吸收利用，且與過量施肥導致土壤酸化、硝酸鹽淋失和溫室氣體排放等關系密切（Wang et al.，2017）。本試驗中不同處理土壤AOA 數量高于AOB，AOA/AOB 值為17.33～39.16，與其他研究者結果相符（Xu et al.，2012；張苗苗 等，2015），進一步證實了酸性土壤中AOA 占主導優勢（楊亞東 等，2017）。設施蔬菜土壤中AOA 和AOB 數量均高于CK，可能與設施土壤氮含量較高有關。Di等（2010）研究表明，無機氮作為氨氧化細菌的能量來源，可促進土壤氨氧化細菌生長。

相關研究表明，AOA 和AOB 數量受多種土壤環境因子影響（Yao et al.，2013）。Pernes-Debuyser和Tessier（2004）研究認為，長期氮肥添加通過氨氧化作用可導致土壤中質子積累，從而降低土壤pH。Chen 等（2013）研究認為，土壤pH 與AOB數量顯著負相關，與AOA 數量沒有顯著相關關系。然而，楊亞東等（2017）研究認為，土壤pH 與AOA 數量顯著正相關，與AOB 數量沒有顯著相關關系。Chen 等（2011）研究也認為，土壤pH 是影響AOA 種群數量變化的主要因素，較低pH 不適合AOB 生長。AOB 利用的底物為氨分子（NH3），土壤pH 降低將導致NH3轉變為，導致底物NH3濃度降低。本試驗中，隨種植年限延長，土壤pH 值逐漸降低，驅動NH3轉化為-N，可能是造成AOB 數量減少的主要因素（Macqueen & Gubry-Rangin，2016）。然而，AOA 對底物氨分子（NH3）的親和力強于AOB（Willm et al.，2009），且適應較低pH 環境（He et al.，2012）。由此可知，在設施蔬菜長期種植中AOA 可能在氨氧化過程發揮重要作用。

然而，本試驗中AOA 和AOB 數量級低于楊亞東（2018）在農田土壤的研究結果，設施蔬菜長期種植降低了AOA 和AOB 數量。AOA 和AOB 數量變化趨勢一致，隨設施種植年限延長逐漸降低，均高于CK。AOA 數量在不同種植年限中有顯著變化，與陳秋會（2014）研究結果相反。Shen 等（2011）通過研究不同氮水平下我國菜地土壤AOB 數量的變化，發現氮肥顯著提高菜地土壤AOB 數量。以上研究結果的差異，可能與研究區域施肥組成、施肥水平、取樣時間和立地條件等因素有關。由此可知，AOA 和AOB 數量對不同土壤環境因子的差異響應，將導致AOA 和AOB 生態位發生分離。

3.2 AOA 和AOB 群落及其與土壤化學性質的關系

種植年限3 a 和5 a 的AOA 和AOB 群落豐富度和多樣性指數均高于CK，但種植7 a 的AOA 和AOB 群落豐富度和多樣性指數低于CK。由此可知，適宜種植年限有利于增加AOA 和AOB 群落多樣性，長期種植將降低AOA和AOB群落多樣性；可能由于長期施用氮肥，特別是銨態氮是引起土壤AOA 和AOB 群落結構發生變化的主要因素（Willm et al.，2009）。本試驗中，種植年限對AOA 群落的影響最大，與Chen 等（2013）的研究結果相反。然而，Wang 等（2009）和Shen 等（2011）分別在水稻土壤和半干旱溫帶草原土壤中發現，施氮對AOA 群落組成沒有顯著影響。研究結果的差異原因可能包含：①本試驗對象為設施蔬菜，具有獨特的生態環境，不同于農田（水稻）和草原生態系統。② AOA 生長極其緩慢，需要經過長期處理后才可檢測到變化（K?nneke et al.，2005）。Wang 等（2009）僅在施氮89 d 后就開始對AOA 數量和群落結構進行檢測，而本試驗是設施蔬菜種植多年后才對其進行檢測。

在門分類水平上，AOA 群落中奇古菌門為優勢類群，與杜穎等（2014）研究表明渾善達克沙地的優勢類群結果一致。與種植3 a 相比，種植5 a和7 a 顯著增加了奇古菌門的相對豐度，表明種植年限對其影響較大。AOB 群落中變形菌門的相對豐度占比較高，平均相對豐度達到整個AOB 群落門水平的79.89%。種植3 a 和5 a 的AOA 和AOB群落的變形菌門相對豐度高于7 a 處理，進一步證實了變形菌門具有嗜營養的特點，但有其生態閾值（Fazi et al.，2005）；可知，隨設施蔬菜種植年限延長，土壤養分過量富集，超過變形菌門需要的閾值，將對其有抑制作用。土壤pH、銨態氮和硝態氮是土壤AOA 群落結構的主要因素，與楊亞東（2018）研究結果一致。說明設施蔬菜種植過程中，土壤酸化和氮肥積累直接影響土壤AOA 群落變化。

土壤可利用性氮直接影響AOB 群落結構變化（Hynes & Germida，2012）。土壤銨態氮和硝態氮對AOB 群落結構影響較大，說明設施栽培通過改變銨態氮和硝態氮等指標直接或者間接來影響AOB 群落組成結構變化。為準確評價設施蔬菜種植中土壤氨氧化作用發生規律，需要進一步開展長期的試驗研究。

4 結論

本試驗結果表明，AOA 和AOB 數量、群落的Chao1 指數、ACE 指數和Shannon 指數，隨設施種植年限延長逐漸降低。門水平上，奇古菌門和變形菌門分別為AOA、AOB 群落的優勢類群。設施蔬菜長期種植中，土壤pH 是一個重要指標，土壤pH 與AOA 群落結構有顯著關系，低pH 值可限制硝化微生物生長，不利于硝化過程進行。在設施蔬菜酸性土壤中，硝化作用可能主要由AOA 驅動完成。