基于UPLC-MS的肝癌脾虛濕盛證患者血漿代謝組學(xué)研究?

李晶潔， 劉述梅， 王 東， 劉 江， 呂書(shū)勤

(新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院， 烏魯木齊 830000)

原發(fā)性肝癌是威脅生命的惡性腫瘤，中國(guó)的原發(fā)性肝癌患者數(shù)量位居全球第一，約占全世界總數(shù)量的50%[1]。原發(fā)性肝癌分為肝細(xì)胞癌和肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌，其中肝細(xì)胞癌發(fā)生率約70%～90%，肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌約15%[2]。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是用于診斷原發(fā)性肝癌的主要標(biāo)志物。但在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染的慢性肝炎和肝硬化患者中，AFP含量也偏高[3]，嚴(yán)重干擾著診斷的準(zhǔn)確性，因此有必要篩選更具特異性的肝癌診斷標(biāo)志物。代謝組學(xué)(metabonomics)是以一個(gè)生命體系統(tǒng)中特定生理或病理?xiàng)l件下所有代謝組分的定性定量分析為核心的學(xué)科[4，5]。主要研究目的是揭示某種生理或病理狀態(tài)在代謝水平的規(guī)律。代謝組學(xué)應(yīng)用的技術(shù)包括核磁共振氫譜(1 h-nuclear magnetic resonance，1 H-NMR)、氣相色譜(gas chromatography，GC)、液相色譜(liquid chromatography，LC)和質(zhì)譜分析(mass spectrum，MS)等。應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)可對(duì)原發(fā)性肝癌進(jìn)行代謝水平的模式識(shí)別，尋找潛在的代謝標(biāo)志物，豐富代謝組學(xué)在肝癌研究中的應(yīng)用。

中醫(yī)理論中，“證候”是了解和診治疾病的基礎(chǔ)。肝癌以脾虛為本，氣滯、血瘀、濕邪為標(biāo)[6]。中醫(yī)臨床發(fā)現(xiàn)，肝癌的單證證候包括氣滯、血瘀、脾氣虛、腎陰虛和肝膽濕熱等[7]。單證證候通常組合為復(fù)雜證候出現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)約有40%的腫瘤患者存在脾虛濕盛的癥狀[8]。本文使用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(ultra performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry，UPLC-MS)方法檢測(cè)肝癌脾虛濕盛證患者的血漿代謝組分，并與健康人血漿代謝組分比較，通過(guò)建立偏最小二乘判別分析(partial least squares-discriiminate analysis，PLS-DA)模型鑒別差異代謝物，以期從代謝水平研究肝癌脾虛濕盛證的證候本質(zhì)。該研究已獲得新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院專(zhuān)家委員會(huì)批準(zhǔn),倫理審查批件號(hào)2014XE0113。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本研究招募新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院的肝癌脾虛濕盛證患者16例作為患者組，全部患者均被診斷為原發(fā)性肝癌且為第一診斷。根據(jù)隨機(jī)原則，新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院體檢中心招募21名健康志愿者作為健康組。隨機(jī)招募的肝癌脾虛濕盛證患者中，年齡最大者83歲，最小者35歲；正常對(duì)照組中年齡最大者80歲，最小者24歲，組間年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2組樣本基礎(chǔ)信息見(jiàn)表1。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照第八屆全國(guó)肝癌學(xué)術(shù)會(huì)議上通過(guò)的《原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)》[9]，中醫(yī)脾虛濕盛證參照國(guó)家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《中醫(yī)證候辨治軌范》[10]及《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[11]中的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

符合原發(fā)性肝癌西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)及中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)；由至少兩位以上主治醫(yī)師進(jìn)行中醫(yī)辨證分型；所有病例均自愿并簽署知情同意書(shū)。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

轉(zhuǎn)移性肝癌、良性肝臟腫瘤或原發(fā)合并其他惡性腫瘤；伴有嚴(yán)重心、腦、腎及造血系統(tǒng)等并發(fā)癥；合并活動(dòng)性結(jié)核及嚴(yán)重的感染性疾病；臨床資料不全或不能合作者；年齡在18歲以下；妊娠期或哺乳期婦女。

1.5 樣本采集

所有研究對(duì)象于清晨采集空腹前臂靜脈血2 mL，肝素抗凝，靜置后以5440×g離心10 min，取上層血清于EP管中標(biāo)記姓名及編號(hào)，保存于-80 ℃超低溫冰箱。

1.6 主要儀器

超低溫冰箱(中國(guó)海爾公司，DW-86L578ST)；質(zhì)譜儀(德國(guó)ThermoFisher公司，Q Exactive)；色譜儀(德國(guó)ThermoFisher公司，Accela)；色譜柱(德國(guó)ThermoFisher公司，ScientificTMProPacTMSCX-10)等。

1.7 樣本處理

將血清樣本從-80 ℃冰箱取出，4 ℃解凍，取100 μL置于 EP管中，加入500 μL含0.1%甲酸的80%甲醇水溶液，渦旋震蕩、冰浴靜置5 min，25000×g 4 ℃離心10 min，取一定量的上清加質(zhì)譜級(jí)水稀釋至甲醇含量為60%，并置于帶有0.22 μm濾膜的離心管中，以15000×g 4 ℃離心10 min，收集濾液進(jìn)行UPLC-MS檢測(cè)。

色譜條件：柱溫40 ℃，流速0.2 mL/min，正模式下，流動(dòng)相A為0.1%甲酸，流動(dòng)相B為甲醇；負(fù)模式下，流動(dòng)相A為5 mmol/L醋酸銨，pH9.0，流動(dòng)相B為甲醇。

質(zhì)譜條件：掃描范圍選擇m/z 100-1500；ESI 源設(shè)置：Spray Voltage：3.2kV；Sheath gas flow rate：35 arb；Aux Gas flow rate：10 arb；Capillary Temp：320 ℃。二級(jí)掃描為data-dependent scans。

1.8 代謝物鑒定與定量

將色譜-質(zhì)譜檢測(cè)的下機(jī)數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Compound Discoverer(CD)軟件，首先進(jìn)行保留時(shí)間、荷質(zhì)比等參數(shù)篩選，然后對(duì)不同樣本根據(jù)保留時(shí)間偏差0.1 min 和質(zhì)量偏差5 ppm進(jìn)行峰對(duì)齊，再根據(jù)設(shè)置的質(zhì)量偏差 5 ppm、信號(hào)強(qiáng)度偏差30%、信噪比3、最小信號(hào)強(qiáng)度100000、加和離子等信息提取信號(hào)峰，同時(shí)根據(jù)峰面積進(jìn)行定量，通過(guò)分子離子峰和碎片離子預(yù)測(cè)分子式，并與mzCloud 和Chemspider數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，利用空白樣本數(shù)據(jù)去除背景離子，并對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行歸一化，最后得到代謝物鑒定與定量結(jié)果。

1.9 多元數(shù)據(jù)分析

使用主成分分析法(Principal Component Analysis，PCA)將鑒定的代謝物組合為不同的變量以展示總體代謝組分差異。使用metaX軟件，建立PLS-DA模型。隨后用Y-亂序統(tǒng)計(jì)驗(yàn)證法對(duì)PLS-DA模型進(jìn)行評(píng)估。通過(guò)200次隨機(jī)洗牌，計(jì)算模型擬合度(R2)和預(yù)測(cè)能力(Q2)參數(shù)。理論中，Q2值應(yīng)小于R2即表明模型未被過(guò)擬合。

1.10 差異代謝物篩選

首先利用建立的PLS-DA模型計(jì)算代謝物的變量重要性投影(variable importance in projection，VIP)值。代謝物的VIP值越大，表明其在模型中越關(guān)鍵。然后應(yīng)用t檢驗(yàn)計(jì)算代謝物的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值)。最后，VIP值>1、P<0.05、差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)>2或FC≤0.5的代謝物被認(rèn)為是差異代謝物。根據(jù)log2(FC)和-log10(P值)繪制火山圖，展示差異代謝物。

1.11 層次聚類(lèi)與KEGG富集分析

首先使用標(biāo)準(zhǔn)分?jǐn)?shù)(z-score)將代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后利用R語(yǔ)言中的pheatmap包繪制層次聚類(lèi)熱圖。隨后使用京都基因與基因組百科全書(shū)(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行差異代謝物的代謝通路富集分析。當(dāng)富集通路的P值<0.05時(shí)，被認(rèn)為是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的富集。

2 結(jié)果

2.1 肝癌脾虛濕盛證代謝組分特征

在正模式和負(fù)模式的UPLC-MS檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，肝癌脾虛濕盛證患者與健康體檢者血漿中有很多相同的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物。圖1展示了患者組與健康組代謝譜中主成分的二維和三維的空間分布，可以看出2組樣本代謝輪廓并不完全重疊。而從代謝譜的空間分布來(lái)看，健康人的代謝譜相比于肝癌脾虛濕盛證患者表現(xiàn)出更好的組內(nèi)團(tuán)聚性。

注：A.負(fù)模式下第一主成分和第二主成分的二維投影；B.負(fù)模式下PCA的三維投影；C.正模式下，第一主成分和第二主成分的二維投影；D.正模式下PCA的三維投影

圖2A和2B示，根據(jù)代謝物定性定量結(jié)果構(gòu)建PLS-DA模型，模型中每個(gè)樣本在正負(fù)模式下的第一、第二主成分在二維空間中的投影。2個(gè)組群被明顯分離，且每組中大部分樣本都處于95%置信區(qū)間內(nèi)。圖2C和2D示，對(duì)PLS-DA模型的排序檢驗(yàn)結(jié)果在正模式和負(fù)模式下，Q2值均小于R2值說(shuō)明PLS-DA判別模型的有效性。

注：A.負(fù)模式下PLS-DA模型第一主成分和第二主成分的二維投影；B.正模式下PLS-DA模型第一主成分和第二主成分的二維投影；C.負(fù)模式PLS-DA模型過(guò)擬合驗(yàn)證；D.正模式PLS-DA模型過(guò)擬合驗(yàn)證

2.2 差異代謝物篩選結(jié)果

圖3示，根據(jù)VIP值>1、P值<0.05、差異倍數(shù)(FC)>2或FC≤0.5的標(biāo)準(zhǔn)篩選肝癌脾虛濕盛證患者代謝譜中的差異代謝物。圖3A為負(fù)模式下的代謝譜，共鑒定出2242種代謝物，差異代謝物有293種，其中95種顯著上調(diào)，198種顯著下調(diào)；圖3B是正模式下的代謝譜，共鑒定出1430種代謝物，差異代謝物有167種，其中70種顯著上調(diào)，97種顯著下調(diào)。

注：A.負(fù)模式下篩選的差異代謝物；B.正模式下篩選的差異代謝物

表2示，肝癌脾虛濕盛證患者組血漿中呋喃酮、琥珀酸、葡萄糖苷、β-D-吡喃半乳糖苷、5-羥色胺、植酸萘二酚、檸檬酸和甘油三酯的代謝水平顯著低于健康對(duì)照組；而皂皮酸、甘氨酸、環(huán)絲氨酸、甘油酸、乙酸丁酯、羅沙替丁、丹酚酸、吡喃糖醛酸、丙二酸和膽酸的代謝水平卻顯著高于健康對(duì)照組。

表2 肝癌脾虛濕盛證患者血漿中部分差異代謝物比較

2.3 層次聚類(lèi)與KEGG富集結(jié)果

將代謝物相對(duì)定量值經(jīng)過(guò)z-score轉(zhuǎn)換后，對(duì)樣本間代謝物的代謝模式進(jìn)行層次聚類(lèi)分析。圖4示，相似代謝模式的樣本會(huì)聚為一簇，可以看出正負(fù)模式下肝癌患者組的代謝模式與健康對(duì)照組均有明顯不同。

圖4示，差異代謝物在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中所富集的代謝通路。表3示，根據(jù)P值排序，負(fù)模式下最顯著富集的通路是“Drug metabolism-cytochrome P450”，正模式下最顯著富集的通路是“Taurine and hypotaurine metabolism”。在肝癌脾虛濕盛證的血漿中，差異代謝物顯著富集的生化代謝途徑和信號(hào)傳導(dǎo)通路共6個(gè)。

表3 肝癌脾虛濕盛證血漿中差異代謝物富集通路結(jié)果比較

注：A.負(fù)模式下代謝物聚類(lèi)熱圖；B.正模式下代謝物聚類(lèi)熱圖；C.負(fù)模式差異代謝物富集通路；D.正模式差異代謝物富集通路

3 討論

肝癌的發(fā)病及臨床表現(xiàn)與濕邪的性質(zhì)與特點(diǎn)相似。在肝癌早期常無(wú)任何癥狀和體征，迨至濕邪已重卻又變證多端。肝癌中晚期患者常有肝區(qū)疼痛、食欲減退、乏力、消瘦、黃疸、腹水等多種臨床表現(xiàn)，舌苔也以膩苔多見(jiàn)[12]。由此可見(jiàn)，其發(fā)病過(guò)程均與濕邪密切相關(guān)。濕邪傷脾，運(yùn)化無(wú)權(quán)，水谷精微不得消化吸收,氣血生化不足，肢體失于濡養(yǎng)，可見(jiàn)胃納減退，神疲乏力，形體消瘦，腹脹便溏；脾虛不能運(yùn)化水濕，濕痰內(nèi)聚，阻滯氣機(jī)，升降失常，可見(jiàn)腹?jié)M便閉、胸脅作痛、惡心嘔吐；脾失健運(yùn)，濕壅中焦，滯而化熱，延及肺腎，水液滯留則面浮肢腫、腹脹如鼓且尿少。脾虛生濕，濕阻氣滯，氣滯則血運(yùn)無(wú)力可致血瘀，氣滯血瘀，脈絡(luò)不和，積而成塊，故脅痛拒按，固著不移。積塊日久，血絡(luò)瘀結(jié)，中氣大傷，運(yùn)化無(wú)權(quán)，故疼痛加劇，飲食大減，消瘦脫形。濕毒是肝癌發(fā)病的重要致病因素，濕毒內(nèi)蘊(yùn)是肝細(xì)胞癌變的病理基礎(chǔ)，痰瘀蘊(yùn)結(jié)是肝臟癌變的基本病理變化。

使用多元分析策略對(duì)肝癌脾虛濕盛證代謝譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了鑒定和差異代謝物篩選。在總體PCA分析結(jié)果中，健康對(duì)照組樣本比患者組樣本表現(xiàn)出更強(qiáng)的團(tuán)聚性，說(shuō)明肝癌脾虛濕盛證患者的血漿代謝組分發(fā)生異常，代謝功能紊亂程度加重。PLS-DA模型顯示，患者組和對(duì)照組的樣本明顯分離，隨后根據(jù)PLS-DA模型計(jì)算VIP值以表示各代謝物對(duì)肝癌脾虛濕盛證的貢獻(xiàn)程度。最后篩選出負(fù)模式下293種差異代謝物，正模式下167種差異代謝物。

在差異代謝物中發(fā)現(xiàn)，肝癌脾虛濕盛證患者的糖代謝、膽汁酸代謝和氨基酸代謝發(fā)生了不同程度的異常?；颊哐獫{中檸檬酸和琥珀酸水平均明顯低于正常人。檸檬酸和琥珀酸都是三羧酸循環(huán)的重要中間產(chǎn)物，而三羧酸循環(huán)是糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)代謝的共同代謝途徑[13]，表明肝癌脾虛濕盛證患者的三羧酸循環(huán)機(jī)制受到嚴(yán)重影響。肝臟是合成糖代謝途徑中多種關(guān)鍵酶的主要場(chǎng)所，檸檬酸和琥珀酸水平的下調(diào)預(yù)示肝癌細(xì)胞調(diào)控糖代謝能力有所減弱[14]，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，肝癌脾虛濕盛證患者血漿中的膽酸水平顯著升高。膽酸是膽固醇代謝過(guò)程中的中間物，可作為前體合成膽汁中的多種膽汁酸[15]。生理過(guò)程中，膽汁酸可促進(jìn)腸-肝系統(tǒng)對(duì)膽固醇和脂質(zhì)的吸收[16]。而膽酸在血液中水平升高說(shuō)明膽汁酸的合成途徑受阻，因此膽酸可作為肝癌脾虛濕盛證的候選生物標(biāo)志物。此外，患者組血漿中甘氨酸、環(huán)絲氨酸等氨基酸含量高于對(duì)照組，說(shuō)明肝癌脾虛濕盛證使多肽合成受到影響。脾虛時(shí)運(yùn)化失權(quán)，腐熟功能失職，患者胃腸功能減退，如食欲差、攝入量少、吸收不良，導(dǎo)致機(jī)體不能從食物中攝取足量的必需氨基酸，而出現(xiàn)血漿里多種氨基酸含量降低。肝細(xì)胞受損時(shí)消耗谷胱甘肽會(huì)導(dǎo)致甘氨酸被大量轉(zhuǎn)化[17]。陸偉[18]等報(bào)道，肝癌細(xì)胞的體外培養(yǎng)也會(huì)發(fā)生氨基酸水平異常，因此肝癌細(xì)胞很可能與肝細(xì)胞受損有類(lèi)似的氨基酸代謝表征。同時(shí)KEGG富集分析顯示，多個(gè)通路與肝癌脾虛濕盛證存在關(guān)聯(lián)。Drug metabolism-cytochrome P450是細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)藥物代謝相關(guān)通路。臨床通常采用聯(lián)合用藥治療肝癌，肝損傷出現(xiàn)頻率甚高[19]。CYP450是藥物體內(nèi)代謝的主要酶，是發(fā)生藥源性肝損傷的關(guān)鍵因素[20]。因此，在治療肝癌患者時(shí)，或可考慮選擇能夠抑制CYP450活性的藥物，盡量避免肝損傷。

本研究通過(guò)與健康人群的代謝譜進(jìn)行比較，確定了脾虛濕盛證肝癌的代謝表征，一定程度上反映了脾虛濕盛證肝癌的病理生理變化，這種認(rèn)識(shí)疾病的方法既有現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)識(shí)疾病的特點(diǎn)，又結(jié)合了中醫(yī)辨證的特征，對(duì)于探索中醫(yī)“同病異證”具有很大的優(yōu)勢(shì)。本研究利用代謝組學(xué)技術(shù)豐富了中醫(yī)證候理論的生物學(xué)基礎(chǔ)，同時(shí)為尋找精準(zhǔn)診斷肝癌脾虛濕盛證的潛在生物標(biāo)志物提供了可能。隨著代謝組學(xué)技術(shù)的日益成熟和研究的不斷深入，以及與各種組學(xué)技術(shù)的成功對(duì)接，相信將在原發(fā)性肝癌早期診斷、治療、預(yù)后的研究中發(fā)揮更大的作用，最終將廣泛應(yīng)用于臨床，造福于患者。