基于質譜技術的外泌體蛋白質組學在腫瘤診斷中的研究進展*

楊 柳,張 勇,童學東 綜述，鄧 昆△ 審校

重慶醫科大學附屬第三醫院檢驗科，重慶 401120

早在1983年，在綿羊網織紅細胞中發現了外泌體，其被認為是“細胞碎片”或細胞排出代謝廢物的一種形式。有研究發現，血液中外泌體的濃度較高(>109particles/mL)，腫瘤患者血液中的外泌體濃度普遍高于健康人，與腫瘤的大小、淋巴結轉移數量及腫瘤細胞類型密切相關[1]，進一步研究發現，由于囊泡內攜帶的生物信息分子(脂質、蛋白質、RNA等)存在差異，不同細胞來源的外泌體在人體內發揮不同的功能。如間充質干細胞來源的外泌體可修復組織損傷、抑制腫瘤細胞的增殖；而腫瘤細胞來源的外泌體可進入微環境，隨體液循環在局部或遠處操控腫瘤微環境，促進血管生成、腫瘤侵襲和轉移[2]。在體液循環中，外泌體的尺寸和數量因受細胞間質壓力、氧化應激、營養剝奪及pH值等的影響存在較大差異。由此可見，外泌體與腫瘤的發生和發展具有高度的相關性。以往的研究主要通過檢測體液(如血液、尿液、唾液等)中蛋白質組成實現腫瘤標志物的篩選，然而這些復雜樣本中的蛋白質濃度跨度達10～12個量級。現存的質譜技術鑒定蛋白濃度差僅為6～7個量級，所以這些樣本中某些低豐度蛋白容易被技術忽略。相對于復雜的體液，外泌體內蛋白質濃度跨度較小，因此，應用液相色譜串聯質譜技術(LC-MS/MS)研究外泌體蛋白質組學有望成為篩選腫瘤特異性生物標志物的有效方法。

1 外泌體蛋白質的組成及分類

外泌體是一種直徑為30～150 nm的細胞外囊泡，由各種類型的細胞(免疫細胞、組織細胞、腫瘤細胞等)通過內溶酶體途徑釋放至細胞外。首先，細胞質膜向內凹陷形成內體,內體膜進一步向內凹陷，將細胞質內含物、跨膜蛋白和外周蛋白整合至囊泡內，形成多囊泡體(MVB)。然后，MVB通過與細胞質膜融合，以胞吐的方式釋放到細胞外環境，成為脂質雙分子膜包裹的納米顆粒，也就是外泌體。內體分類復合物參與調節和引導特定分子進入MVB，主要的4個內體分類復合物(ESCRT 0、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)負責將泛素化蛋白傳遞至溶酶體內降解或參與蛋白回收，因此，ESCRT系統的組件(TSG101和Alix等蛋白)在外泌體中表達豐富。但ESCRT并不是介導外泌體形成的唯一機制，其他獨立于ESCRT的過程也可能參與外泌體生物的發生和釋放。例如，四次跨膜蛋白家族中的CD9、CD63和CD81已被證明參與內體小泡的運輸，這一類參與外泌體形成并在不同細胞來源的外泌體中穩定表達的蛋白被稱為外泌體非特異性來源蛋白，主要包括四次跨膜蛋白家族成員(CD9、CD63、CD81、CD82)、膜融合和轉運相關的蛋白(Annexins、Alix、TSG101)及細胞骨架蛋白(微管蛋白、肌絲蛋白、微絲結合蛋白)，它們廣泛應用于外泌體的表征(如蛋白質免疫印跡法和膠體金電鏡)或作為蛋白標志物參與外泌體的分離純化(如免疫親和法)，見圖1。進一步深入研究發現，外泌體作為一種新型的信息交流載體，參與了人體內一系列的生理病理過程。介導外泌體與目的細胞相互作用的機制包括以下3種：(1)外泌體與細胞膜融合，釋放外泌體內的生物信息分子;(2)外泌體通過胞吞作用進入受體細胞;(3)外泌體膜蛋白與目的細胞受體相互識別，激活目的細胞內信號通路。見圖2。KALRA 等[3]研究發現,外泌體攜帶的β-catenin可與細胞上特異性受體識別，激活腫瘤細胞中的Wnt通路，這一類能夠反映細胞來源和/或介導某一特定生理病理過程的蛋白質被稱為外泌體來源特異性蛋白，它們與腫瘤的發生和發展密切相關，具有早期篩查或診斷腫瘤的潛力[4]。無論來源特異性蛋白或來源非特異性蛋白均可通過基于質譜技術的外泌體蛋白質組學進行鑒別，其中分離純化外泌體是外泌體蛋白質組學分析的基礎，為后續外泌體的功能研究或腫瘤標志物篩選提供了保障。

圖1 外泌體組成和結構圖

注：(1)為外泌體與細胞膜融合，釋放外泌體內的生物信息分子;(2)外泌體通過胞吞作用進入受體細胞;(3)為外泌體膜蛋白與目的細胞受體相互識別，激活目的細胞內信號通路。

2 外泌體的分離方法

外泌體來源于細胞上清液、組織及不同類型的體液(如血液、腦脊液、胸腔積液等)，各種分離方法不同程度地受免疫復合物、高密度脂蛋白的影響。因此，有效分離富集高純度的外泌體是外泌體蛋白質組學研究至關重要的一部分。現階段分離純化外泌體主要從尺寸、密度、免疫表型等進行。基于尺寸的分離方法主要有體積排阻色譜法和超濾法[5]，其共同點是分離獲取的外泌體生物活性不受影響，無需昂貴的超速離心設備，但是體積排阻色譜法提取出的外泌體濃度較低，超濾法也存在濾膜堵塞和使用壽命較短的問題；基于密度的分離方法主要有超速離心法和蔗糖密度梯度離心法[6]，其優點是分離出的外泌體純度較高，方法學構建成熟，適合于不同的樣本體積(1～480 mL),但是所需的儀器設備昂貴，耗時較長；基于免疫親和的分離方法主要有磁珠法[7]，其優點是可分離出特定細胞來源的外泌體，但是洗脫液容易影響分離純化的外泌體的生物活性，不利于后續的功能驗證及質譜檢測。隨著新型納米分離技術的發展，研究者逐漸發展出多種新型的外泌體分離方法，以微流控技術為基礎實現外泌體分離的方法受到廣泛關注，主要包括微流體過濾[8]、聲波分離[9]及免疫親和捕獲[10]，其共同特點是所需樣本量較少、分離速度快、純度高等。其中基于免疫親和捕獲的微流控芯片具有實現診斷分離一體化的潛能，有利于診斷方法學的建立。

目前，超速離心法分離獲取外泌體在基于質譜技術的外泌體蛋白質組學研究中最為常見。2015年，DUTTA等[11]利用超速離心法分離出膽管癌細胞株來源的外泌體，利用質譜技術對其進行了功能分析。隨著外泌體的深入研究，發現通過密度梯度離心法和超速離心法聯合使用可進一步提高外泌體的純度。2016年，CLARK 等[12]采用蔗糖密度梯度離心法聯合超速離心法成功分離出肺癌細胞株來源的外泌體，用于后續氨基酸同位素胞內培養(SILAC)質譜技術分析非小細胞肺癌生物標志物。有研究發現，密度梯度離心法聯合超速離心法獲取的外泌體已經失去了生物活性[13]。由此可見，超速離心法更適合于以功能分析為目的的外泌體蛋白質組學，而密度梯度離心法聯合超速離心法更適合于以篩選生物標志物為目的的蛋白質組學。因此，外泌體分離純化方法的選擇主要取決于研究目的。2018年國際細胞外囊泡協會提出外泌體分離純化可通過兩種方法聯合使用提高特異性和外泌體亞型的分離[13]。相信不久的將來會出現關于如何根據不同研究目的選擇相應的外泌體分離方法的研究指南和統一標準。

3 常用于外泌體蛋白質組學研究的質譜技術

相對于蛋白芯片而言，質譜技術對蛋白質的鑒定不受抗體限制，可鑒定未知種類的蛋白質。質譜技術由于靈敏度高、特異性強、分析范圍寬等特點已逐漸成為蛋白質組學的主要研究手段。隨著外泌體相關研究數量日益增加，基于質譜技術的外泌體蛋白質組學研究策略也逐漸完善。目前，用于蛋白質組學研究的質譜技術分為非靶向蛋白質組學質譜技術和靶向蛋白質組學質譜技術，其中非靶向蛋白質組學質譜技術是檢測樣本中所有在檢測限范圍內的蛋白質，多用于外泌體內差異蛋白質的篩選或信號通路分析，根據用于蛋白質定量的方法，它可分為標記定量技術(包括化學標記定量技術和代謝標記定量技術)和非標記定量技術。而靶向蛋白質組學質譜技術是對數十個目標蛋白質進行檢測，多用于已知蛋白質的驗證，主要包括多反應監測質譜技術和平行反應監測質譜技術。不同質譜技術的優點和局限性不同，見表1，可根據樣本數量、樣本類型或后續研究目的進行選擇。

表1 常用于蛋白質組學研究的質譜技術的優點和局限性

3.1非靶向蛋白質組學質譜技術

3.1.1標記定量技術

3.1.1.1化學標記定量技術 ROSS等[14]研究發現，通過引入不同種類的同位素對不同的樣本標記后，可將待測樣本混合同時上樣進行質譜檢測，減少樣本的批間誤差，進而提高數據的準確性。目前，常用于外泌體蛋白質組學研究的化學標記定量技術主要包括TMT和iTRAQ兩種，均采用同位素與肽段的氨基反應，通過等重標記原理對不同樣本進行標記，同時上機檢測不同樣本的同一肽段在質譜儀中的離子信號響應強度，實現所有蛋白質的相對定量。TMT和iTRAQ的主要差別在于標記樣本的數量不同。TMT是由AB Sciex公司研發，適合于2標、6標、10標或16標；而iTRAQ是由Thermo Fisher Scientific公司研發，適合于4標或8標。2012年，DE JONG等[15]利用iTRAQ LC-MS/MS對應激狀態下內皮細胞來源的外泌體進行蛋白質組學分析，發現其內蛋白質濃度發生了明顯改變。

3.1.1.2代謝標記定量技術 SILAC是一種體內標記技術，首先它將輕、中、重型C/N同位素標記在L-賴氨酸和L-精氨酸兩種必需氨基酸上，然后將標記了同位素的氨基酸與細胞共培養(>5代)或飼養正常的動物，通過正常細胞代謝，實現95%及以上的蛋白質標記，適合于2標或3標。在外泌體蛋白質組學的研究中，SILAC主要用于細胞株來源的外泌體。由于無需體外人工標記處理，對蛋白質標記的保真性較高。2012年，LI等[16]通過SILAC對淋巴細胞進行培養，成功分離出同位素標記的外泌體。

3.1.2非標記定量技術 非標記定量技術是通過比較不同樣本中同一肽段對應的質譜峰面積或質譜峰數，直接獲取該肽段所代表的蛋白的相對定量信息。有學者通過檢測酶解后的肽段對應的質譜峰面積來預估蛋白質濃度，應用此方法預估的蛋白質濃度和實際蛋白質濃度相差不超過16%[16]。RAPPSILBER等[17]將質譜峰數直接轉換為肽段數，通過比較某一蛋白質對應的肽段數和胰蛋白對應的肽段數(也就是蛋白豐度指數)進行相對定量。ISHIHAMA等[18]進一步研究發現，蛋白豐度指數和蛋白濃度呈線性相關(r=0.89)。上述非標記定量的質譜采集模式均為數據依賴性采集(DDA)，即一級質譜僅采集每個掃描周期信號強度為前10～20的母離子進行碎裂和二級質譜分析。2012年，GILLET等[19]在一級質譜的采集方式上進行優化，即采集全部的母離子信息，提出了數據采集模式稱為數據非依賴性采集(DIA)，它是通過采集每個掃描周期內所有的母離子進行碎裂和二級質譜分析，實現蛋白質的鑒定和相對定量，其特點是獲取蛋白質的信息更全面，但對數據處理的要求更高。相對于標記定量而言，非標記定量可用于任何類型的樣本，并且無需前期復雜的標記技術，在減低蛋白質濃度損失的同時降低了實驗成本。2012年，CHOI等[20]利用基于DDA模式的非標記定量技術在結直腸癌細胞株來源的外泌體中篩選出可用于輔助判斷腫瘤轉移的標志物。

3.2靶向蛋白質組學質譜技術

3.2.1多反應監測質譜技術(MRM) MRM的原理是在一級質譜中設定目標蛋白相應的母離子信息，在二級質譜中設定相應子離子信息，通過選擇性地采集母離子-子離子對信號，從而實現目標蛋白的相對定量。2003年，GERBER等[21]研究發現，通過加入不同濃度的內參可實現目標蛋白質的絕對定量，其優點是能夠有效地避免雜質信號的干擾，適合于基質背景較高的樣本。2017年，MEHAFFY等[22]利用MRM成功在血液來源的外泌體中檢測出低豐度蛋白(如Mtb)。MRM是通過測定肽段的數量，從而推斷出蛋白質的數量，在子離子對的采集上存在一定程度的假陽性。因此，目標蛋白的高還原性和保真性有待提升。

3.2.2平行反應監測質譜技術(PRM) 2012年，PETERSON提出了利用高分辨率的質譜儀(orbitrap/TOF)取代三重四極桿中第三級的四極桿質量器采集所有子離子信息，進而對目標蛋白定量，即PRM。2015年，SCHILLING等[23]利用標準肽對PRM進行驗證，發現PRM具有高重現性和選擇性，并且進一步完善了PRM的工作流程。隨著技術的成熟和方法學的完善，PRM用于外泌體蛋白質組學的研究逐漸增多。2017年，DOZIO等[24]利用PRM表征大腦內皮細胞來源的外泌體蛋白，進一步研究了腫瘤壞死因子對外泌體蛋白的影響。相對于MRM而言，PRM主要體現在質譜儀器的升級，無需選擇離子對和優化碎裂能量，耗時短，準確性高，更有利于方法學的建立。

4 外泌體蛋白質組學在腫瘤診斷中的應用

4.1外泌體比較蛋白質組學與腫瘤診斷 腫瘤患者和非腫瘤患者來源的外泌體內攜帶的蛋白質存在明顯差異。有研究表明，外泌體上的整合素(ITG)區域可與轉移的器官選擇性黏附，例如，ITGβ4促進了腫瘤細胞靶向肺轉，而ITGβ5能夠促進腫瘤細胞轉移至肝臟[25]。由此可見，外泌體蛋白質可用于判斷腫瘤轉移的器官。因此，外泌體內攜帶的蛋白質有望成為腫瘤診斷的生物標志物。在腫瘤標志物研究中，比較蛋白質組學主要是通過比較非腫瘤生物樣本和腫瘤生物樣本所有蛋白質的種類與濃度，篩選出潛在腫瘤特異性生物標志物用于診斷腫瘤類型、判斷轉移與否及鑒別轉移來源的器官。CHEN等[26]通過TMT標記的LC-MS/MS對結直腸癌患者和健康人血漿來源的外泌體進行分析，發現了58種差異表達的蛋白質，其中36種上調，22種下調，驗證發現纖維粘連蛋白1(FN1)、胎球蛋白A、熱休克蛋白90(HSP90AA1)是結直腸癌的潛在腫瘤標志物。ZHENG等[27]在前者采用的質譜技術的基礎上進行優化，利用DIA數據采集模式分析發現了20種結直腸癌上調蛋白，并且在健康人(13例)和結直腸癌患者(12例)樣本中，采用PRM驗證了FN1的診斷效能，其受試者工作特征曲線下面積為1.0，明顯高于血清癌胚抗原和血清糖類抗原19-9，有望成為結直腸癌的診斷標志物。WANG等[28]通過TMT LC-MS/MS研究發現，外泌體內的脂多糖結合蛋白可用于判斷非小細胞肺癌是否轉移。而KUANG等[29]應用Label free技術對非小細胞肺癌患者來源的外泌體進行研究發現，β纖維蛋白原和γ纖維蛋白原能夠用于鑒別良性肺結節和惡性肺結節。盡管質譜技術的發展有助于在外泌體蛋白質組學的基礎上發現更多的潛在腫瘤標志物，但是對潛在腫瘤標志物的驗證阻礙了腫瘤標志物臨床轉化的進程。一些外泌體蛋白的診斷效能仍存在一些爭議，一方面是由于缺少驗證方法學之間的比較；另一方面是腫瘤異質性導致臨床樣本之間存在較大差異。MELO等[30]利用酶聯免疫吸附試驗研究發現，外泌體中磷脂酰肌醇聚糖-1(GPC-1)蛋白濃度在胰腺癌患者血液中明顯增加，能夠高特異度(100%)、高靈敏度(100%)地區分胰腺癌患者(246例)、胰腺炎患者(20例)及健康人(37例)。然而，LAI等[31]利用LC-MS/MS檢測發現，外泌體中GPC-1蛋白的濃度在胰腺癌患者(3例)、胰腺炎患者(3例)和健康人(6例)中無明顯差異，并且在術后患者的血液中外泌體的GPC-1蛋白略微降低，無法確認研究之間的差異是來源于不同的方法學還是腫瘤臨床樣本的異質性。因此，外泌體腫瘤標志物在實現臨床普及之前,仍需加大樣本量對其診斷效能進行驗證或通過對驗證方法標準化進而加強不同實驗室數據之間的整合來確認差異來源。HOSHINO等[32]通過加大臨床樣本量(311例)并聯合細胞株樣本(115例)開展了基于TMT LC-MS/MS的外泌體蛋白質組學研究，鑒別了腫瘤組織來源(85例)和癌癥患者血液(127例)、淋巴引流液(13例)、膽管液(20例)來源的外泌體特異性表達的蛋白，發現多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白C、血小板凝血敏感酶蛋白2可以用于癌癥(如肺癌、胰腺癌、結直腸癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤等)的篩查，并且可對未知的原發腫瘤進行分類。除此之外，在其他不同類型的腫瘤中，也有應用質譜技術篩選外泌體腫瘤標志物的研究。

4.2外泌體修飾蛋白質組學與腫瘤診斷 經翻譯后修飾的蛋白(如磷酸化蛋白、糖基化蛋白、甲基化蛋白等)在腫瘤細胞內異常表達，與細胞的功能狀態密切相關。如游離的磷酸蛋白具有高度的特異性，但是血液中存在磷酸活性酶可將其降解，因此，血液中游離的磷酸化蛋白不適合作為腫瘤標志物。外泌體的脂質雙分子層能夠阻止血液中蛋白酶對其內容物的降解。因此，經翻譯后修飾的蛋白質在外泌體中穩定存在，是區分腫瘤狀態和健康狀態的潛在標志物。外泌體中的糖基化蛋白和磷酸化蛋白濃度明顯高于血液，PAN等[33]利用DIA LC-MS/MS研究發現，非小細胞肺癌患者與健康人血漿中的黏蛋白1(MUC-1)水平無明顯差異，而MUC-1由于糖基化在外泌體中選擇性富集，因此，非小細胞肺癌患者來源的外泌體中的糖基化MUC-1濃度較健康人約上升1.5倍。WEERAPHAN等[34]在膽管癌細胞的體外轉移模型中利用Label-free LC-MS/MS發現，源自高侵襲性細胞株中43個外泌體蛋白磷酸化濃度發生明顯變化，其中值得注意的是磷酸化HSP90與膽管癌細胞的惡性程度呈正相關，可成為膽管癌轉移與否的潛在標志物。而CHEN等[26]采用label-free質譜技術，在乳腺癌患者血漿外泌體中檢測出100多種磷酸化蛋白，這些蛋白質的濃度明顯高于健康對照組。在13例乳腺癌患者和7例健康人血液來源的外泌體中，采用PRM質譜對4種[環磷酸鳥苷依耐性蛋白激酶1(PKG1)、鳥苷三磷酸酶激活蛋白亞基2(RALGAPA2)、盒結合蛋白1(NFX1)、緊密連接蛋白2]明顯上調的磷酸化蛋白進行驗證，其中PKG1、RALGAPA2、NFX1P的濃度均存在明顯差異，有望成為乳腺癌早期診斷的標志物。

5 總結及展望

腫瘤細胞來源的外泌體通過特殊的分選機制富集生物信息分子，被大量分泌進入腫瘤外環境，通過旁分泌和內分泌方式作用于靶細胞，參與腫瘤的發生、發展及轉移過程。由于質譜檢測技術的更新和數據采集分析方式的不斷優化，比較蛋白質組學的蛋白覆蓋率和靈敏度均有所提高，可檢測出更多腫瘤來源的特異性外泌體蛋白。翻譯后修飾的蛋白質組學在外泌體研究中的應用，也增加了外泌體蛋白質組學在腫瘤致病機制、功能及疾病關聯等方面的研究深度。盡管基于質譜技術的外泌體蛋白質組學在腫瘤診斷標志物的研究中得到廣泛應用，但是驗證和發展可用于臨床診斷的腫瘤標志物目前仍存在許多挑戰，主要包括以下3個方面：(1)多種技術和儀器帶來了多種研究策略，難以保證不同研究策略結果之間的可重復性，阻礙了不同實驗室數據間的比對與整合；(2)樣本制備、數據采集和數據分析自動化程度較低，增加了研究成本；(3)現階段研究臨床樣本數量偏少，對于腫瘤標志物的診斷效能驗證不足，尚不能實現臨床轉化。因此，一方面可以通過加強對不同技術和儀器之間的方法學研究，尋找出不同方法學之間的差異，旨在完善外泌體蛋白質組學方法的研究指南和針對不同研究策略的選擇標準，通過對研究策略的標準化，從而實現不同實驗室之間數據的整合；另一方面，可以采用多中心聯合的模式在增加臨床研究樣本數量的同時消除地域因素影響，建立具有中國特色的外泌體蛋白質表達圖譜。