基于指紋圖譜技術(shù)與主成分分析優(yōu)化苦參中苦參總堿的提取條件

鑒志剛，葉世蕓*，殷少文，劉 巧，張艷琴

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550002；2.貴陽市第三人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550006；3.貴州得軒堂護(hù)康藥業(yè)股份有限公司，貴州 貴陽 550008)

苦參總堿是中藥苦參(Sophora flavescens)的提取物，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等功效[1]。近年來，除傳統(tǒng)的滲漉法、萃取法[2]及回流法外，微波輔助法[3]、鹽輔助法[4]、超聲法[5]等新技術(shù)亦逐步應(yīng)用于苦參總堿的提取純化中。

由于中藥“多組分”的特點(diǎn)，在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)過程中，檢測(cè)單一成分或少數(shù)幾種成分，難以有效評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的優(yōu)劣[6]。而應(yīng)用中藥指紋圖譜技術(shù)則可極大避免遺漏有效成分，可更加全面反映中藥中化學(xué)成分的種類及含量，從而獲取可有效代表中藥化學(xué)成分的信息，現(xiàn)已成為國內(nèi)外廣泛接受的一種中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方式[7]。由于中藥化學(xué)成分的多樣性及復(fù)雜性，各組分權(quán)重系數(shù)較難確定，因而中藥成分的綜合分析難度較大。主成分分析法(Principal component analysis，PCA)是一種利用降低緯度思想，在少損失甚至不損失原有指標(biāo)信息的基礎(chǔ)上，把多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)相互獨(dú)立指標(biāo)的一種定量分析方法，運(yùn)用主成分分析可通過少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)反映原始指標(biāo)的絕大部分信息，達(dá)到化繁為簡(jiǎn)的目的，指紋圖譜技術(shù)結(jié)合主成分分析技術(shù)已應(yīng)用于中藥有效成分質(zhì)量控制[8]、基源種類區(qū)別[9]及工藝參數(shù)的優(yōu)化[10]等方面。

本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，以溶劑濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比為考察因素，比較乙醇回流法與乙醇超聲法提取苦參總堿的效果差異。采用HPLC法建立苦參總堿粗提取物指紋圖譜，并對(duì)其共有峰峰面積進(jìn)行主成分分析，以主成分分析所得到的總因子得分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選苦參中苦參總堿的最佳提取條件，為苦參質(zhì)量評(píng)價(jià)與苦參總堿最佳提取方法的篩選提供思路與依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(型號(hào)：1260 HPLC；廠商：Agilent)；超聲清洗儀(型號(hào)：YQ-1000A；廠商：上海易凈超聲波儀器有限公司)；藥典篩(廠商：紹興市上虞張興沙篩廠)；高速多功能粉碎機(jī)(型號(hào)：HC-S4；廠商：永康市天琪盛世貿(mào)有限公司)；色譜柱(規(guī)格：4.6 mm×250 mm，5 μm；型號(hào)：Welch Ultimate XB-NH2)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(型號(hào)：101-1A；生產(chǎn)廠商：天津天泰儀器有限公司)；萬分之一天平(型號(hào)：AE240；生產(chǎn)廠商：上海梅特勒有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(型號(hào)：RE-2000B；生產(chǎn)廠商：上海亞榮生化儀器廠)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(型號(hào)：HH-4；生產(chǎn)廠商：常州普天儀器制造有限公司金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠)；永欣可控低溫電爐(型號(hào)：TW-2000W；生產(chǎn)廠商：郫縣永信電器廠)；高速離心機(jī)(型號(hào)：H2050R；生產(chǎn)廠商：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.2 試劑及藥材

苦參采購于藥材市場(chǎng)，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)魏升華教授鑒定為豆科植物苦參(Sophora flavescens)的干燥根；苦參堿對(duì)照品(批號(hào)：110805-201709)；氧化苦參堿對(duì)照品(批號(hào)：110780-201909)；槐定堿對(duì)照品(批號(hào)：110784-201706)；槐果堿對(duì)照品(批號(hào)：110784-201405)；氧化槐果堿對(duì)照品(批號(hào)：111652-200301)均購于中國食品藥品檢定研究院，純度均大于98%；乙腈、磷酸、無水乙醇為色譜純，水為“哇哈哈”純凈水，95%乙醇、鹽酸等其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Welch Ultimate XB-NH2(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相乙腈-無水乙醇-3%磷酸(85∶7.5∶7.5)，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，進(jìn)樣量10 μL[11]。

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品溶液配制 取標(biāo)準(zhǔn)品氧化槐果堿、氧化苦參堿、苦參堿、槐定堿、槐果堿適量，精密稱定，用乙腈-無水乙醇(85∶15)溶解定容。分別配制成含槐果堿 0.018 05 mg/mL、苦參堿 0.074 4 mg/mL、氧化苦參堿 0.318 0 mg/mL、槐定堿 0.149 6 mg/mL、氧化槐果堿 0.152 6 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 苦參總堿浸膏制備 稱取苦參粉末32份，每份約10.0 g，采取乙醇回流、乙醇超聲2種提取方式，按照表1中條件提取，提取液過濾后，棄去濾渣，濃縮提取液至最小體積，用1%HCl調(diào)節(jié)濃縮液pH 3～4后過濾，棄去濾渣，續(xù)濾液用10%NaOH調(diào)節(jié)pH 10～11。分別用濾液體積1倍、0.5倍、0.5倍、0.5倍的氯仿進(jìn)行萃取，收集氯仿層并回收氯仿，95%乙醇溶解后，揮干溶劑，制得稠浸膏。精密稱取浸膏0.6 g，5 mL無水乙醇溶解后，精密量取溶液1.0 mL至25 mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，備用。

表1 乙醇回流法、超聲法設(shè)計(jì)因素與水平

2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取乙醇回流正交實(shí)驗(yàn)1號(hào)提取條件下供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD，結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.73%～1.32%，相對(duì)峰面積的RSD為0.88%～2.70%。這說明儀器精密度良好，符合指紋圖譜要求。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取乙醇回流正交實(shí)驗(yàn)1號(hào)提取條件下供試品溶液，分別于0、1、2、3、5、8 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD，結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.77%～1.88%，相對(duì)峰面積的RSD為0.47%～1.88%。結(jié)果表明，供試品在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取乙醇回流正交實(shí)驗(yàn)1號(hào)提取條件下供試品溶液，重復(fù)制備6次，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD，結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.31%～1.16%，相對(duì)峰面積的RSD為1.79%～2.70%。結(jié)果表明，供試品制備方法重復(fù)性良好。

2.5 苦參HPLC指紋圖譜的建立

取混合對(duì)照品溶液及“2.2.2”項(xiàng)下按正交實(shí)驗(yàn)表配制的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定并記錄色譜圖，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》軟件進(jìn)行分析，設(shè)定S1為參照色譜，對(duì)色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正及數(shù)據(jù)匹配，時(shí)間寬度為0.1 min，生成苦參HPLC指紋圖譜疊加圖。結(jié)果顯示，在不同提取工藝產(chǎn)生的指紋圖譜中，共確定12個(gè)共有峰，通過與混合對(duì)照品色譜圖比對(duì)相對(duì)保留時(shí)間，可確定2號(hào)峰為槐果堿、4號(hào)峰為苦參堿、6號(hào)峰為氧化槐果堿、10號(hào)峰為槐定堿、11峰為氧化苦參堿。見圖1、圖2、圖3、圖4。

圖1 混合對(duì)照品HPLC色譜

圖 2 空白對(duì)照色譜

圖3 乙醇回流法特征峰匹配圖譜

圖4 乙醇超聲法特征峰匹配圖譜

2.6 指紋圖譜主成分分析

2.6.1 主成分提取及貢獻(xiàn)率計(jì)算 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)正交實(shí)驗(yàn)下不同提取方式的各組樣品峰面積進(jìn)行主成分分析法降維處理，提取特征值λ>1的特征根相應(yīng)成分為主成分，獲取可代表原始峰面積的主成分及相應(yīng)貢獻(xiàn)率，主成分總方差的解釋見表2、表3，結(jié)果顯示，兩種不同提取方法下分別選取了3～4個(gè)主成分，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率分別為88.098%、90.647%，滿足主成分累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)85%的要求，說明提取的主成分可以代表原始色譜峰峰面積的絕大部分信息。

表2 乙醇回流法主成分總方差解釋

表3 乙醇超聲法主成分總方差解釋

2.6.2 綜合評(píng)價(jià)[12]運(yùn)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件分別計(jì)算兩種不同提取方式選取的各個(gè)主成分得分，即F1=主成分1的成分得分系數(shù)/初始特征值的算術(shù)平方根，以此類推分別算出各個(gè)主成分的得分，再根據(jù)特征向量推導(dǎo)出不同提取方式的主成分綜合得分方程：F乙醇回流法=0.689 26F1+0.189 45F2+0.124 30F3，F(xiàn)乙醇超聲法=0.672 94F1+0.121 33F2+0.106 19F3+0.099 55F4，按照公式分別計(jì)算不同提取條件下不同樣品的綜合得分。見表4。

表4 不同提取條件下PCA綜合得分

2.7 正交實(shí)驗(yàn)工藝優(yōu)化

本研究選取乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)、液料比(D)等4個(gè)因素作為考察對(duì)象，以各個(gè)樣品綜合得分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)直觀分析與方差分析，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與直觀分析結(jié)果見表5、表6，方差分析結(jié)果見表7、表8。

表5 乙醇回流法正交實(shí)驗(yàn)直觀分析結(jié)果

表6 乙醇超聲法正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果

表7 乙醇回流法正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

表8 乙醇超聲法正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

從正交實(shí)驗(yàn)直觀分析結(jié)果看，兩種提取方式下4種因素均對(duì)提取效果產(chǎn)生一定影響，乙醇回流提取條件下影響因素A>C>D>B，乙醇超聲提取條件下影響因素C>D>B>A，從方差分析結(jié)果看，乙醇回流提取方式下A因素對(duì)提取效果影響最大，其次是C，再次為D，最小為B，而各個(gè)因素對(duì)提取效果均無顯著影響，考慮到提取效率及生產(chǎn)成本，確定最優(yōu)組合為A4B1C1D4(13倍90%乙醇，回流提取60 min，共提取1次)，乙醇超聲提取方式下對(duì)提取效果影響最大的因素為C，其次為D、B，最小為A，而除了C因素外，其他因素對(duì)提取效果無明顯作用，考慮到實(shí)際提取效率及生產(chǎn)成本，確定最優(yōu)組合為A3B1C4D1(10倍85%乙醇，超聲提取60 min，共提取4次)。兩種提取方式相比，乙醇回流提取方式下藥材長(zhǎng)期處于加熱狀態(tài)下易導(dǎo)致苦參生物堿結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[13]，影響產(chǎn)出的苦參總堿質(zhì)量，故綜合考慮提取效率、生產(chǎn)成本、產(chǎn)品安全性等方面，采用乙醇超聲條件下最優(yōu)組合提取苦參總堿。

2.8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取苦參粉末約10.0 g，精密稱定，按上述正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的工藝平行制備6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.2%，相對(duì)峰面積RSD均小于2.3%，且綜合分析各共有峰面積得到6份樣品的綜合得分為2.6，表明實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性好，得到的最佳提取工藝穩(wěn)定、切實(shí)可行。

3 討論

中藥指紋圖譜技術(shù)是一種整體、綜合、可量化反映藥物內(nèi)部較多活性成分的定性、定量方法，其主要以色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積進(jìn)行定性，以色譜峰面積進(jìn)行半定量，近年來常用于中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制[14-18]。本研究選用L16(44)正交實(shí)驗(yàn)，建立乙醇超聲法、乙醇回流法兩種提取條件下苦參指紋圖譜，分別確定了12、12個(gè)共有峰，利用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)共有峰峰面積進(jìn)行了主成分分析法降維分析，分別確定了4、3個(gè)可代表原始共有峰信息的主成分，以其綜合得分為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)直觀分析與方差分析，比較兩種提取方法分析結(jié)果，優(yōu)選出苦參最佳提取工藝參數(shù)，得出供試品提取時(shí)使用10倍 85%乙醇超聲提取4次，60 min/次的提取優(yōu)化方案，為苦參總堿最佳提取方法的篩選提供了思路與依據(jù)，但受制于實(shí)驗(yàn)規(guī)模及相關(guān)技術(shù)條件，實(shí)驗(yàn)室g級(jí)樣品優(yōu)選的最佳提取工藝在中試中是否還應(yīng)保持一致仍需深入研究。

溶劑提取法是苦參中苦參總堿提取的常用基本方法，其操作簡(jiǎn)單，成本低，適于工業(yè)化生產(chǎn)，超聲輔助提取技術(shù)可使藥物細(xì)胞壁破裂，加速有效成分溶出，提高提取效率，縮短提取時(shí)間，在苦參總堿提取中發(fā)展前景良好[19]。2015年版《中華人民共和國藥典》中采用氯仿作為溶媒，超聲法提取苦參堿，具有較好的提取效果[11]，但考慮到氯仿對(duì)人體心、肝、腎等器官有一定損害，具有一定危險(xiǎn)性，故本研究采用安全性較高的乙醇作為溶劑，減少苦參總堿分離純化過程中可能產(chǎn)生的有毒溶劑殘留，提高了實(shí)驗(yàn)安全性。通過對(duì)色譜條件的考察，進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描[20]，結(jié)果顯示，在220 nm時(shí)吸收最大，檢出峰各峰比例合適，基線較平穩(wěn)，可基本反映出苦參中苦參總堿的整體面貌，故選擇以220 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本研究建立了苦參生物堿指紋圖譜，采用HPLC法以主成分分析得到的總因子得分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，而有研究者對(duì)苦參提取工藝進(jìn)行優(yōu)化時(shí)選用滴定法測(cè)定苦參總堿的含量，以苦參總堿含量為指標(biāo)進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，但滴定法專屬性不強(qiáng)，滴定終點(diǎn)的判斷易受主觀因素影響，人為誤差較大，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[21]。HPLC法準(zhǔn)確度好，專屬性強(qiáng)，不易受雜質(zhì)干擾，可全面覆蓋苦參中大部分有效成分，全面性與綜合性強(qiáng)，可更好地控制苦參總堿的質(zhì)量與提取效果。

本研究將指紋圖譜技術(shù)與化學(xué)計(jì)量法相結(jié)合用于中藥苦參提取工藝優(yōu)化，全面考察了藥材提取狀況的同時(shí)又簡(jiǎn)化了數(shù)據(jù)，便于分析，具有一定的實(shí)用性與適用性。