HPLC法測(cè)定麥冬安神合劑中斯皮諾素含量

盧文華，鄧光明，楊鳳全，李 希，王 琳，王 玉*

(1.三臺(tái)縣中醫(yī)院，四川 綿陽(yáng) 621100；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院 中醫(yī)研究所，四川 成都 610031)

麥冬安神合劑可養(yǎng)陰、益氣、安神，用于治療氣陰虧虛、心腎失交所致的失眠，療效顯著。麥冬安神合劑由麥冬、酸棗仁、太子參、茯神木等7味中藥組成，其中，君藥麥冬養(yǎng)陰清熱，含有多種甾體皂甙、胡蘿卜素等成分，具有抗疲勞、清除自由基、鎮(zhèn)靜催眠、抗心肌缺血、抗心律失常等作用[1-7]。炒酸棗仁、太子參、茯神木共為臣藥，諸藥合用可補(bǔ)氣安神。炒酸棗仁鎮(zhèn)靜、催眠作用顯著，其有效成分是皂苷類及黃酮類化合物，鎮(zhèn)靜、催眠作用比安定更持久平穩(wěn)[8-15]。太子參含有多種人參皂甙，可調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮過(guò)程及抑制過(guò)程，還可調(diào)節(jié)神經(jīng)功能，恢復(fù)由于緊張?jiān)斐傻纳窠?jīng)過(guò)程紊亂，有明顯中樞鎮(zhèn)靜作用[16-18]。茯神木含有蛋白質(zhì)、茯苓多糖等有效成分，具有增強(qiáng)生理活性、刺激免疫系統(tǒng)功能恢復(fù)、安神健胃的作用[19-20]。在實(shí)驗(yàn)中，君藥麥冬的多種甾體皂甙含量測(cè)定均有干擾，難以反映麥冬安神合劑的質(zhì)量。因此，采用高效液相色譜法測(cè)定臣藥炒酸棗仁的有效成分斯皮諾素，可為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀(美國(guó)沃特世有限公司)；2489型UV/Vis 檢測(cè)器(美國(guó)沃特世有限公司)；BT-125D型分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；YPR-10T型超純水器(北京英普瑞環(huán)保設(shè)備有限公司)；AS20500T型超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

1.2 材料

斯皮諾素對(duì)照品(批號(hào)：111869-201704，純度：97.2%)由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；麥冬安神合劑樣品(由三臺(tái)縣中醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)：20200301、20200302、20200303)；乙腈、甲醇、磷酸為色譜純，水為超純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件考察

2.1.1 色譜柱篩選 參考文獻(xiàn)[10-15]，結(jié)合化合物性質(zhì)，斯皮諾素采用以C18為填充劑的反相色譜柱測(cè)定。分別考察色譜柱Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent extend-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、DIKMA Diamonsil-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、SHIMADZU VP-ODS(4.6 mm×150 mm，5 μm)，結(jié)果顯示，Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)保留時(shí)間合適、分離度高，選擇Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)。

2.1.2 流動(dòng)相篩選 參考文獻(xiàn)[10-15]，本實(shí)驗(yàn)分別考察了乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、甲醇-水4種流動(dòng)相組合。結(jié)果4種流動(dòng)相組合色譜圖效果無(wú)明顯差異，分離度、對(duì)稱性均良好，其中甲醇-水系統(tǒng)有一緊挨的相鄰峰干擾。結(jié)合實(shí)際操作便利性，擬定乙腈-水為流動(dòng)相。

2.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)篩選 參考相關(guān)方法，斯皮諾素所示色譜峰光譜吸收曲線圖在335 nm處附近均有較強(qiáng)的紫外吸收，335 nm波長(zhǎng)下該色譜峰對(duì)稱性好、響應(yīng)值較高，擬采用檢測(cè)波長(zhǎng)為335 nm。

2.1.4 柱溫與流速篩選 本實(shí)驗(yàn)分別考察了常用柱溫25、30、35 ℃，常用流速0.8、1.0、1.2 mL/min。結(jié)果柱溫與流速對(duì)色譜圖效果影響無(wú)明顯差異，選擇柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，在該柱溫與流速下，待測(cè)色譜峰與鄰峰均無(wú)干擾，分離度良好，峰對(duì)稱性良好。

2.1.5 洗脫程序篩選 實(shí)驗(yàn)對(duì)乙腈-水系統(tǒng)的檢測(cè)時(shí)間及梯度作出優(yōu)化，結(jié)合色譜圖效果及檢測(cè)效率，擬定洗脫程序?yàn)?～10 min，12%～19% A；10～16 min，19%～20% A；16～22 min，20%～98% A；22～35 min，98% A；35～40 min，98%～12% A。

2.1.6 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙睛(A)-水(B)，梯度洗脫程序?yàn)?～10 min，12%～19% A；10～16 min，19%～20% A；16～22 min，20%～98% A；22～35 min，98%A；35～40 min，98%～12% A；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)335 nm，進(jìn)樣量10 μL，理論板數(shù)按斯皮諾素峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取斯皮諾素對(duì)照品10.31 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液2 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度線，搖勻，即得(每1 mL含斯皮諾素80.170 6 μg)。

2.2.2 供試品溶液制備考察 提取方式及溶劑種類篩選：精密吸取本品2 mL，2份，分別置5 mL量瓶中，分別加甲醇、乙醇近刻度線，超聲處理1 h，放冷，再加相應(yīng)溶劑定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。精密吸取本品2 mL，2份，分別置5 mL量瓶中，分別加甲醇、乙醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量。見(jiàn)表1。

表1 不同提取方式及溶劑種類含量

由結(jié)果可知，超聲、振搖兩種提取方式含量無(wú)明顯差異，擬選振搖。甲醇與乙醇提取的含量差異不大，擬選甲醇提取。

提取溶劑濃度篩選：精密吸取本品2 mL，5份，分別置5 mL量瓶中，分別加甲醇、90%甲醇、80%甲醇、70%甲醇、60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量。見(jiàn)表2。

表2 不同提取溶劑濃度含量

由結(jié)果可知，不同甲醇濃度提取無(wú)明顯差異，結(jié)合實(shí)驗(yàn)操作便利性等因素，擬定提取溶劑濃度為甲醇。

提取溶劑用量篩選：精密吸取本品3、2、2、1、1 mL，各1份，分別置5、5、10、10、25 mL量瓶中，分別加甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量。見(jiàn)表3。

表3 不同提取溶劑用量含量

由結(jié)果可知，各溶劑用量下，溶劑比高于2～10 mL溶劑后含量趨于平衡，結(jié)合實(shí)驗(yàn)成本及操作便利性等因素，擬定2 mL成品所用提取溶劑用量為10 mL。

供試品溶液制備方法：精密量取本品2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性供試溶液制備 按照處方比例，取除酸棗仁外的其他藥材，按制備工藝制成缺酸棗仁的陰性樣品，按照上述篩選的供試品溶液制備方法，制成陰性供試溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性供試溶液，按“2.1.6”色譜條件進(jìn)樣，色譜見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，陰性樣品無(wú)干擾，專屬性良好。

注：A對(duì)照品色譜；B供試品溶液色譜；C陰性供試溶液。

2.3.2 線性與范圍實(shí)驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液(80.170 6 μg/mL，線性1)3、2、1、1、1 mL置5、5、5、10、25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列濃度對(duì)照品溶液。按上述色譜條件測(cè)定峰面積，結(jié)果見(jiàn)表4。以進(jìn)樣濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出線性回歸方程。由結(jié)果得出回歸方程為：Y=22 958X+4 592(r=1)，結(jié)果表明，斯皮諾素在80.170 6 μg/mL～3.206 8 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表4 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 精密度實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照品溶液(線性3)，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄色譜圖，測(cè)定每次進(jìn)樣的斯皮諾素峰面積，結(jié)果見(jiàn)表5。由結(jié)果可知，斯皮諾素精密度以峰面積計(jì)RSD為1.44%，結(jié)果表明，該儀器精密度良好。

表5 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取本品，按供試品溶液制備方法制成供試品溶液，共6份。按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果見(jiàn)表6。由結(jié)果可知，斯皮諾素重復(fù)性以峰面積計(jì)RSD為0.26%，結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性較好。

表6 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

2.3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別取供試品溶液及對(duì)照品溶液(線性3)于0、2、4、6、8、10、16、20、24 h，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。記錄峰面積，結(jié)果見(jiàn)表7。由結(jié)果可知，供試品及對(duì)照品以峰面積計(jì)RSD分別為1.74%、0.84%，結(jié)果表明，該供試品溶液、對(duì)照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表7 穩(wěn)定性考察

2.3.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取本品(按重復(fù)性實(shí)驗(yàn)計(jì)算斯皮諾素含量均值為0.092 9 mg/mL)1 mL，共6份，各精密加入對(duì)照品溶液(80.170 6 μg/mL)1 mL，按供試品溶液的制備方法制備加樣供試品溶液6份。按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表8。由結(jié)果可知，平均回收率為95.37%，RSD=0.67%，表明該方法的加樣回收率較好，該方法的準(zhǔn)確度良好。

表8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批麥冬安神合劑樣品(批號(hào)：20200301、20200302、20200303)適量，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液。取對(duì)照品溶液、供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 樣品斯皮諾素含量測(cè)定

3 討論

麥冬安神合劑君藥麥冬含有多種甾體皂甙，其中，魯斯可皂苷元為藥效成分，但在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該成分HPLC測(cè)定存在陰性干擾等問(wèn)題，難以作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定指標(biāo)。針對(duì)以上問(wèn)題，優(yōu)選臣藥炒酸棗仁的藥效成分斯皮諾素為質(zhì)量控制指標(biāo)，其斯皮諾素亦為制備工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)納入斯皮諾素為含量測(cè)定成分，可有效反映本品工藝優(yōu)劣。炒酸棗仁中斯皮諾素測(cè)定，目前已有薄層掃描法、高效液相法等。本實(shí)驗(yàn)建立的麥冬安神合劑中斯皮諾素高效液相色譜含量測(cè)定方法，經(jīng)系統(tǒng)方法學(xué)研究，具有良好的精密度、準(zhǔn)確度及穩(wěn)定性，簡(jiǎn)單易操作、可行性強(qiáng)，可用于麥冬安神合劑的質(zhì)量控制。