LC-MS/MS法測(cè)定跳骨片中馬兜鈴酸I含量

劉嘉澍，妙 苗，李 青，康小鳳，樊寶娟

(陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710065)

跳骨片處方由燙骨碎補(bǔ)、煅自然銅、土鱉蟲(chóng)、醋乳香、醋沒(méi)藥、紅花、細(xì)辛等二十味藥材組成，用于治療骨折、脫臼及新久傷痛等，用于消腫定痛、活血舒筋，促進(jìn)骨痂生長(zhǎng)[1-2]。該品種被國(guó)家藥典委員會(huì)列為年度國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高工作(中藥)名單，因其組方中包含細(xì)辛，故要求針對(duì)制劑中馬兜鈴酸的含量進(jìn)行限量檢查。細(xì)辛來(lái)源為馬兜鈴科植物北細(xì)辛AsarumheterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.、漢城細(xì)辛AsarumsieboldiiMiq.var.seou1enseNakai，或華細(xì)辛AsarumsieboldiiMiq.的干燥根和根莖，含有微量的馬兜鈴酸I。研究[3-4]表明，馬兜鈴酸具有腎毒性作用，可引起急性馬兜鈴腎病、腎小管功能障礙性馬兜鈴腎病等。同時(shí)，跳骨片中細(xì)辛為直接粉碎后壓片，占處方的2.34%，因此，建立靈敏度較高的測(cè)定馬兜鈴酸I限量檢查方法，對(duì)保證跳骨片的質(zhì)量及用藥安全具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用LC-MS/MS方法，大幅提高了分析效率[5]，增加了定性的準(zhǔn)確性，并確定了最低檢測(cè)限度，為跳骨片安全評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 儀器、試藥及樣品

1.1 儀器

高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜系統(tǒng)(美國(guó)AB公司)，包括LC30A液相色譜系統(tǒng)，AB Qtrap 5500質(zhì)譜儀，Analyst工作站；BP211D分析天平(賽多利斯公司)，ME204分析天平(梅特勒公司)，KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)。

1.2 試劑與材料

馬兜鈴酸I(批號(hào)：110746-201611)，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；水為超純水，乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.3 樣品

11批跳骨片(批號(hào)：190210、190616、190618、190910、191005、200101、200104、200618、200810、201127、201201)，由廠家提供或通過(guò)正規(guī)渠道購(gòu)買獲得。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack Velox C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.7 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%甲酸為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫；流速0.3 mL·min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。[6]

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序[7]

電噴霧離子源(ESI)；正離子檢測(cè)；電暈放電電流為3.0 A；離子源溫度為 500 ℃；離子源氣體 1(N2)壓力為50 psi；氣簾氣體(N2)壓力為 30 psi；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)：掃描時(shí)間為100 ms，離子對(duì)及其他參數(shù)見(jiàn)表2[8-10]。

表2 馬兜鈴酸I質(zhì)譜分析參數(shù)

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液制備 精密稱定馬兜鈴酸I對(duì)照品(批號(hào)：110746-201611)10.96 mg，至100 mL量瓶中，以70%甲醇作為溶劑，配制成濃度為109.6 μg·mL-1的溶液作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 供試品溶液制備 取供試品適量，除去包衣，研細(xì)，取約2.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，功率40 kHz)30 min，取出，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 細(xì)辛藥材溶液制備 取對(duì)應(yīng)批次的細(xì)辛藥材中粉適量，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，同供試品溶液方法制備，作為細(xì)辛藥材溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

精密量取馬兜鈴酸I對(duì)照品儲(chǔ)備液(濃度：109.6 μg·mL-1)1 mL，置于100 mL量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，搖勻，作為線性中間溶液(濃度：1.096 μg·mL-1)；分別精密量取線性中間溶液0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1 mL、2.5 mL、5 mL，各置50 mL量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，即得濃度分別為2.192 ng·mL-1、4.384 ng·mL-1、10.96 ng·mL-1、21.92 ng·ml-1、54.8 ng·mL-1、109.60 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣1 μL至質(zhì)譜儀中，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

結(jié)果可得，馬兜鈴酸I進(jìn)樣量在2.192～109.60 ng·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程：y=1 110.976 65x+ 1 504.134 77 (r=0.999 79)。

該方法最低檢出量為2.192 pg(S/N=3)，對(duì)應(yīng)跳骨片供試品的檢出限為22.7 ng·g-1。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液1 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，按上述條件測(cè)定保留時(shí)間及峰面積，結(jié)果RSD分別為0.30%與0.54%，說(shuō)明該方法精密度良好。

2.5 回收率試驗(yàn)

取供試品(批號(hào)：200101，未檢出馬兜鈴酸I未檢出)適量，除去包衣，取約2.2 g，平行9份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入馬兜鈴酸I對(duì)照品溶液(濃度：109.6 ng·mL-1)1 mL，(濃度：1.096 μg·mL-1)0.5 mL、1.5 mL，各3份，按供試品溶液制備方法同法制備，即得。由表3可得，該方法回收率良好。

表3 回收率考察

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液及回收率試驗(yàn)中4號(hào)加標(biāo)供試品溶液，分別在0 h、3 h、6 h、10 h、14 h、18 h、24 h按上述方法，測(cè)定含量并記錄，RSD為0.98%和1.06%。這說(shuō)明對(duì)照品與供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 限度確定[11-12]

2020年版《中華人民共和國(guó)藥典：一部》收載的細(xì)辛質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，在其馬兜鈴酸I檢查項(xiàng)下的限度為“細(xì)辛藥材及飲片含馬兜鈴酸I不得過(guò)0.001%”；跳骨片處方中細(xì)辛用量為7 g，制成總量為300 g，經(jīng)折算，初步擬定跳骨片中含馬兜鈴酸I不得過(guò)0.23 μg·g-1，見(jiàn)圖1。

圖1 馬兜鈴酸I的檢出限、限度及樣品圖譜

2.8 樣品含量測(cè)定

取11批次的跳骨片，按上述供試品處理方法制備、測(cè)定，見(jiàn)表4。

表4 11批樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)分別考察了乙腈-0.1%甲酸(35∶65)，乙腈-0.1%甲酸(50∶50)[13]，乙腈-0.1%甲酸(80∶20)等不同比例等度洗脫的流動(dòng)相，除出峰時(shí)間差異較大外，峰型均有不同程度拖尾或擴(kuò)散，故采用梯度洗脫并調(diào)整出峰時(shí)間。按文中流動(dòng)相梯度洗脫，峰型有明顯改善，保留時(shí)間合適，樣品洗脫較完全，減少了對(duì)后續(xù)進(jìn)樣的干擾。

3.2 離子對(duì)選擇

3.3 藥材測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)還分別考察了其中5批制劑對(duì)應(yīng)投料的2批藥材的含量，其馬兜鈴酸I含量分別為652 ng·g-1、534 ng·g-1，雖然低于藥典要求限度，但仍有檢出，且跳骨片制劑為藥材原粉入藥，更應(yīng)對(duì)其制劑含量進(jìn)行控制。

本實(shí)驗(yàn)建立的馬兜鈴酸I限量檢查方法簡(jiǎn)便、快捷，靈敏度較高，對(duì)跳骨片的臨床用藥安全和質(zhì)量控制具有重要的指導(dǎo)作用。同時(shí)，筆者認(rèn)為，鑒于馬兜鈴酸對(duì)腎臟的傷害不可逆，且目前無(wú)針對(duì)性治療方法，故應(yīng)對(duì)仍在生產(chǎn)的處方含有細(xì)辛、關(guān)木通等馬兜鈴科植物的制劑品種，補(bǔ)充、制定馬兜鈴酸I的限量控制，并進(jìn)一步尋找可替代成分，減少用量，以達(dá)到用藥安全的目的。