基于層次分析法和正交設計法優選盆消灌腸液的提取工藝

蔡妮娜，曹富寧，謝 寧，范源俊，李小金，夏循明

(南寧市中醫醫院，廣西 南寧 530001)

盆消灌腸液的立方根據慢性盆腔炎熱、毒、濕、瘀、寒的病機特點，以清熱利濕、活血化瘀、養血通絡為治療原則，由丹參、赤芍、三棱、莪術、當歸、大血藤、蒲公英、紫花地丁、敗醬草、桂枝、馬鞭草等多種藥材配伍組成。前期臨床觀察發現，盆消灌腸液具有清熱解毒、活血化瘀、止痛之功效，對緩解慢性盆腔炎腹痛、腰骶脹痛、帶下量多、經期腹痛、炎性包塊及子宮壓痛等癥狀有顯著的療效[1-2]。通過查閱文獻[2-7]可知，盆消灌腸液中，各藥材有效組分主要為酚酸類、苯丙素類、苷類及黃酮類等，均以一定比例乙醇作為提取溶劑，為使有效成分充分浸出，同時滿足本院制劑生產實際條件，本研究采用滲轆提取法，以方中有效成分綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B的含量和干膏得率作為評價指標，采用層次分析法(AHP)確定各指標權重系數，以乙醇濃度、乙醇用量、浸漬時間和滲漉速度為考察因素，結合正交設計實驗法優選出最佳滲轆提取工藝，為該制劑的大生產提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1260 InfinityⅡ型HPLC儀，包括四元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器、色譜工作站 (美國Agilent公司)；十萬分之一XS205電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；WH-800超聲波清洗機(濟寧萬和超聲電子設備有限公司，功率：800 W，頻率：40 kHz)；Best-S30超純水機(芷昂儀器上海有限公司)。

1.2 材料

丹參、赤芍、三棱、莪術、當歸、大血藤、蒲公英、紫花地丁、敗醬草、桂枝、馬鞭草飲片均購于安徽德昌藥業飲片有限公司，經南寧市中醫醫院制劑室曹富寧副主任中藥師鑒定，符合有關規定；綠原酸(中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-200413，純度：98.70%)、咖啡酸(成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-20032003，純度：99.48%)、芍藥苷(成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-19110118，純度：98.69%)、阿魏酸(成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-20032928，純度：98.32%)、丹酚酸B(成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-19062808，純度：99.79%)；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 正交試驗設計

在預試驗基礎上，確定乙醇濃度(A)、乙醇用量(B)、浸漬時間(C)和滲漉速度(D)為影響因素，每個因素各取3個水平進行 L9(34)正交試驗，正交試驗因素水平見表1。

表1 盆消灌腸液正交試驗因素水平

2.2 供試品的制備

按處方2倍量稱取丹參、赤芍、三棱、莪術、當歸、大血藤、蒲公英、紫花地丁、敗醬草、桂枝、馬鞭草等藥材各9份，每份765 g，打成粗粉，按表1因素水平安排滲漉提取實驗，各組藥液分別用紗布過濾后，最后定容至500 mL，即得。

2.3 干膏率測定

精密吸取供試品25 mL，置于已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干后，移至烘箱中，105 ℃干燥3 h，取出，置干燥器中冷卻30 min，迅速取出，精密稱定質量，根據公式計算干膏率：干膏率(%)=(所得浸膏凈重/藥材量)×100%。正交試驗干膏率結果，見表4。

2.4 綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B的含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈(A)-0.1%磷酸(B)為流動相進行梯度洗脫(0～10 min，10%A，10～40 min，10%→17%A，40～45 min，17%→24%A，45～60 min，24%A)；5種成分的檢測波長分別為：0～20 min綠原酸及咖啡酸320 nm，20～30 min芍藥苷230 nm，30～40 min阿魏酸320 nm，40～60 min丹酚酸B 280 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃，進樣量：10 μL[8]。

2.4.2 溶液制備 對照品溶液配制：各對照品儲備液制備：精密稱取綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B對照品適量，加甲醇制成每1 mL含綠原酸0.632 0 mg、咖啡酸0.215 0 mg、芍藥苷2.406 mg、阿魏酸0.040 0 mg、丹酚酸B 2.088 mg的溶液。混合對照品溶液：分別精密吸取各對照品儲備液適量，加甲醇制成每1 mL含綠原酸0.075 8 mg、咖啡酸0.025 8 mg、芍藥苷0.481 2 mg、阿魏酸0.008 0 mg、丹酚酸B 0.250 6 mg的混合對照品溶液。

供試品溶液配制：精密吸取供試品5 mL，置于20 mL容量瓶，加相應溶劑稀釋至刻度，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

陰性對照品溶液配制：取缺少莪術、桂枝、三棱、馬鞭草藥材的處方量，按“2.2”項下方法，制備陰性對照樣品，按“2.4.2”項下供試品溶液的制備方法制備，即得陰性對照品溶液。

2.4.3 系統適應性試驗 取“2.4.2”項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液適量，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，供試品溶液色譜圖中，在與對照品色譜相應位置上有相同的色譜峰，且陰性對照品對測定無干擾，說明該方法可行。

注：1.綠原酸；2.咖啡酸；3.芍藥苷；4.阿魏酸；5.丹酚酸B。

2.4.4 線性關系考察 分別精密吸取混合對照溶液2、6、8、14、20 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積。以峰面積為縱坐標、進樣量為橫坐標，進行線性回歸計算，即得綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B的回歸方程、相關系數及線性范圍。結果表明，5種指標成分在各自含量范圍內線性關系良好，見表2。

表2 線性關系考察結果

2.4.5 定量限與檢測限考察 精密吸取“2.4.2”項下對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。按信噪比為10∶1、3∶1 分別計算定量限、檢測限。結果，綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B定量限分別為25.28、8.600、802.0、11.43、417.6 ng，檢測限

分別為7.584、2.580、240.6、3.428、125.3 ng。

2.4.6 精密度考察 精密吸取混合對照品溶液10 μL，按“2.4.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，以峰面積指標計算RSD(n=6)。結果：綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B峰面積的RSD分別為1.36%、1.30%、0.76%、1.24%、0.56%，表明儀器精密度良好。

2.4.7 重復性考察 取同一供試品適量，按“2.4.2”平行制備6份供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件，同時測定綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B的峰面積，計算其峰面積RSD分別為0.82%、0.48%、0.56%、0.36%、1.61%(n=6)，表明方法重復性良好。

2.4.8 穩定性考察 取同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、16、24 h，按“2.4.1”項下色譜條件進樣，測定綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B的峰面積，計算其峰面積RSD分別為1.89%、0.76%、0.43%、0.79%、1.58%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內的穩定性良好。

2.4.9 加樣回收實驗 分別精密吸取已知各成分含量(綠原酸0.398 9 mg/mL、咖啡酸0.055 0 mg/mL、芍藥苷1.882 4 mg/mL、阿魏酸0.027 7 mg/mL、丹酚酸B 0.948 0 mg/mL)的供試品溶液0.5 mL，共6份，分別置于5 mL量瓶中，精密加入適量對照品儲備液溶液，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液。按“2.4.1”項下色譜條件進樣，測定峰面積，計算綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B平均加樣回收率分別為97.93%、97.75%、96.86%、97.11%、98.67%，RSD值分別為1.81%、2.63 %、1.84%、2.99%、2.87%，表明方法回收率良好。

2.5 層次分析法(AHP)確定各考察指標的權重系數

2.5.1 構建成對比較的判斷優先矩陣 根據盆消灌腸液的處方方解及各成分藥理作用強弱，采用1～9標度法對6項指標進行兩兩比較評判重要性，確定綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B的含量、干膏得率6項指標的優先順序：綠原酸=咖啡酸=丹酚酸B>芍藥苷=阿魏酸>干膏率，構建成對比較的判斷優先矩陣，見表3。

表3 各指標3個層次的優先矩陣

2.6 基于層次分析法的 L9(34)正交試驗分析

按“2.4.1”項下色譜條件測定各指標性成分的含量，按“2.3”項下方法計算供試品溶液的干膏率。采用歸一化法計算每個指標分值，綜合評分計算公式如下：綜合評分=(綠原酸含量/最大綠原酸含量)×100×W1+(咖啡酸含量/最大咖啡酸含量)×100×W2+(芍藥苷含量/最大芍藥苷含量)×100×W3+(阿魏酸含量/最大阿魏酸含量)×100×W4+(丹酚酸B含量/最大酚酸B含量)×100×W5+(大干膏率/最大干膏率)×100×W6。以綜合評分考察乙醇濃度、乙醇用量、浸漬時間和滲漉速度對滲漉提取工藝的影響，通過直觀分析和方差分析優選出最佳滲漉提取工藝條件。結果見表4、表5。

表4 正交試驗安排與結果

表5 方差分析

實驗結果表明，各因素對盆消灌腸液提取工藝作用主次為A>C>B>D，即乙醇體積分數>浸漬時間>乙醇用量>滲轆速度，乙醇體積分數對提取效果的影響最大，而滲轆速度影響最小。方差分析表明，A因素對提取效果具有顯著性影響(P<0.05)。根據直觀分析結果，取各因素較高水平組合，最終確定最佳工藝參數為A2B2C3D1，即加8倍量70%乙醇，浸漬48 h后，以3 mL/min流速進行滲轆提取，收集滲漉液。

2.7 滲漉提取工藝驗證

按最佳提取工藝制備3批樣品，測定樣品中綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、丹酚酸B、阿魏酸含量和干膏得率，結果表明該滲漉提取工藝穩定可行，見表6。

表6 提取工藝驗證結果

3 討論

中藥復方具有多組分、多靶點的作用特點，設置多指標檢測標準已成為優化中藥復方制劑提取工藝的重要手段[10]。本研究采用主、客觀結合的權重系數法-層次分析法，以確定多項指標的權重值。本制劑具有清熱解毒、活血化瘀、止痛之功效，在各項指標兩兩比較判斷矩陣中，大血藤、蒲公英、紫花地丁、敗醬草、丹參主要發揮了本方“清熱解毒，祛瘀止痛”之功效，且在方中用量較大，因此以大血藤、蒲公英、紫花地丁、敗醬草共有成分[11-13]綠原酸、咖啡酸的含量和丹參的丹酚酸B的含量作為最重要的指標，計分最高；赤芍的芍藥苷及當歸的阿魏酸重要程度次之。提取液中的多糖、淀粉以及鞣質、樹膠、樹脂等成分并非本實驗提取的最終目標，故干膏率重要程度要次于其他考察指標。因此，確定各指標優先順序為：綠原酸=咖啡酸=丹酚酸B>芍藥苷=阿魏酸>干膏率。結果顯示，指標權重系數符合一致性評價要求，表明該評價方法具有可行性。

本研究確定盆消灌腸液最佳滲漉提取工藝為：處方量藥材粉碎成粗粉，加8倍量70%乙醇作溶劑，浸漬48 h后，以3 mL/min的速度滲漉，收集滲漉液。該提取工藝條件經驗證，合理可行，能為盆消灌腸液制劑大生產提供參考依據。