苓甘五味姜辛湯治療慢性支氣管炎網絡藥理學研究

蔣先偉，馬戰平

(1.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中醫醫院，陜西 西安 710003)

慢性支氣管炎(Chronic bronchitis)為臨床常見的慢性呼吸道疾病，是累及氣管、支氣管黏膜及周圍組織的慢性非特異性炎癥。臨床中以反復發作的咳嗽、咯痰為主要癥狀，可伴或不伴喘息，且具有病程長、起病緩慢、反復發作的特點，該病影響患者生活質量，嚴重威脅患者健康[1]。近年來，隨著中國老齡化社會加劇、環境污染及不健康生活方式等因素的影響，該病發病率逐年遞增，且發病人群出現年輕化趨勢[2]。目前，西藥治療在臨床中應用較為廣泛，但其長期療效不佳，因此，慢性支氣管炎的臨床治療方案應進一步優化。

根據慢性支氣管炎臨床咳、痰等癥狀，可將其歸于中醫“咳嗽”“痰飲”范疇，其根本病機多與肺、脾、腎三臟虛損，痰飲留停肺內有關。痰飲內伏，每逢邪氣外襲則勾動內邪，促使疾病加重。《靈樞·邪氣臟腑病形》云：“形寒寒飲則傷肺。”而苓甘五味姜辛湯為張仲景所創，首載于《金匱要略·痰飲咳嗽病脈證并治第十二》，功擅溫肺化飲，在臨床中療效顯著。匡奕亮等[3]研究顯示，苓甘五味姜辛湯組對比常規西藥治療組，可有效提高治療效果，且治療安全性更高。研究[4]發現，苓甘五味姜辛湯可降低IL-2、IL-4，調節氣道炎癥因子表達，起到治療慢性支氣管炎的作用。

網絡藥理學是將系統生物學及藥理學整合后，經網絡數據庫檢索及計算機虛擬計算后，構建出“藥物-成分-靶點-通路-疾病”間可視化網絡模型，進而通過分析，得出藥物與疾病相關聯的關鍵靶點，從而預測藥物治療疾病的機制[5]。該方法貼合中藥復方多靶點、多通路的治療特點，以及中醫藥對疾病的認知。故本研究采用網絡藥理學方法探究苓甘五味姜辛湯治療慢性支氣管炎可能關聯的靶點及通路，為挖掘苓甘五味姜辛湯的潛在價值提供思路及依據。

1 材料與方法

1.1 苓甘五味姜辛湯有效成分的篩選及獲取

利用中藥藥理學數據庫及分析系統平臺(TCMSP)搜索苓甘五味姜辛湯中茯苓、甘草、南五味子、干姜、細辛的全部化學成分。依據藥物ADME(Absorption，distribution，metabolism，excretion)特性，將口服生物利用度(Oralbioavailability，OB)≥30%，以及類藥性(Drug-likeness，DL)≥0.18作為篩選指標，獲取符合條件的活性成分。

1.2 苓甘五味姜辛湯潛在靶點和相關疾病靶點的獲取

基于TCMSP數據庫，收集茯苓、甘草、五味子、干姜、細辛所有有效成分靶點，并通過Uniprot數據庫將靶點蛋白名更換為官方名稱。利用DrugBank、GeneCards及OMIM數據庫，將“chronic bronchitis”作為搜素關鍵詞進行搜索，將所獲取的疾病靶點進行整合、去重后即得慢性支氣管炎的疾病靶點。

1.3 中藥復方調控網絡構建

首先利用PERL軟件將獲取到的藥物活性成分及潛在靶點與疾病靶點進行比對篩選，得出藥物活性成分可作用于疾病靶點的相關成分與靶點，然后將網絡數據導入Cytoscape 3.8.0 軟件構建中藥復方調控網絡，網絡圖中node1代表藥物，node2代表靶點，edge代表不同節點間的相互關系。

1.4 苓甘五味姜辛湯與疾病交互靶點篩選及PPI網絡構建

應用R軟件進行藥物與疾病交互靶點的并集獲取，并繪制出Venn圖。利用STRING網絡平臺構建網絡互作模型，最低相互作用閾值設為(>0.9)，并去除游離在外的靶點，獲得PPI網絡互作模型圖。將獲得的網絡用Cytoscape 3.8.0 軟件中CytoNCA插件進行核心靶點篩選，獲得相關核心基因。

1.5 GO生物學過程與KEGG信號通路富集分析

采用 R 4.0.2 的 Bioconductor 數據包進行靶點GO生物學功能及KEGG通路富集分析，設置P值為 0.05，q值為0.05進行分析，輸出結果并繪制相應 barplot柱狀圖及氣泡圖，根據最后結果，得出關鍵的生物學過程及相關通路，從而探討苓甘五味姜辛湯治療慢性支氣管炎的相關機制。

2 結果

2.1 苓甘五味姜辛湯活性成分篩選

通過TCMSP平臺檢索，苓甘五味姜辛湯中茯苓得到化學成分34種，甘草280種，南五味子39種，干姜148種，細辛192種。根據口服利用度(OB)及類藥性(DL)篩選得出苓甘五味姜辛湯共有133種主要活性成分，其中茯苓15種，甘草92種，南五味子13種，干姜5種，細辛8種。

2.2 苓甘五味姜辛湯潛在靶點獲取

將獲取到的主要活性成分在TCMSP平臺中再次搜索，并與潛在靶點逐一匹配，去除無靶點活性成分，得到苓甘五味姜辛湯潛在靶點。其中，茯苓31個靶點，甘草1 769個，南五味子7個，干姜54個，細辛164個，共獲得潛在靶點2 026個。然后將獲得的靶點利用Uniprot數據庫平臺將靶點名更正為官方基因名，并剔除重復，最終共獲得1 708個潛在靶點。

2.3 慢性支氣管炎已知靶點獲取

以“chronic bronchitis”作為搜索關鍵詞，在DrugBank、GeneCards、OMIM數據庫進行搜索，獲得已知與疾病相關的靶點，其中，DrugBank獲取到58個，GeneCards獲取到1 853個，OMIM獲取到43個，整合3個數據庫獲得的靶點信息并剔除重復后，最終獲得疾病相關基因1 893個。

2.4 疾病-藥物靶點整合與獲取共同靶點

應用R語言軟件，將獲得的藥物潛在靶點及疾病相關靶點進行整合，獲取到交集基因，然后通過R軟件繪制韋恩圖(venn)，并記錄苓甘五味姜辛湯治療慢性支氣管炎的交集基因，最終獲得共同靶點125個。見圖1。

圖1 藥物-疾病交集基因韋恩圖

2.5 中藥復方調控網絡的構建

將“2.4”中獲得的交集基因導入Cytoscape 3.8.0軟件，構建藥物-成分-疾病-靶點的中藥復方調控網絡圖(見圖2)，其中，外周節點代表藥物成分(三角形代表茯苓，倒三角代表甘草，菱形代表南五味子，八邊形代表干姜，橢圓形代表細辛，平行四邊形代表藥物共有成分)，矩形方陣代表作用靶點。按照Degree進行排序，其節點越大，代表其在網絡中越重要。其中，節點度值居前10位的靶點為PTGS2、ESR1、AR、HSP90AB1、NOS2、PPARG、CDK2、ESR2、CCNA2、SCN5A。節點度值較高的化學成分為槲皮素、山奈酚、氨酚酸、β谷甾醇、茯苓酸A等。

圖2 中藥復方調控網絡

2.6 PPI網絡構建及核心靶點篩選

將獲得的125個交集基因上傳至STRING網絡平臺，進行搜索，更改最低相互作用閾值為>0.9，并除去游離節點，得到圖3，其中每個節點代表每種蛋白，每條邊代表蛋白之間的相互作用，共有125個節點，522條邊。將所獲得的網絡導入Cytoscape 3.8.0軟件，利用CytoNCA插件進一步計算網絡節點的DC、BC、CC、EC、LAC及NC值，得到網絡中DC中位數為6.5，BC中位數為42.64，CC中位數為0.150 9，EC中位數為0.046，LAC中位數為2.944，NC中位數為3.675。根據網絡藥理學篩選方法，得到關鍵基因39個，再次進行分析后獲得核心基因15個，分別是ESR1、AKT1、CCND1、MAPK14、JUN、STAT3、MAPK1、NR3C1、TP53、CDKN1A、MAPK8、RELA、MAPK3、MYC、RB1。這些靶點在網絡中作為核心靶點，在苓甘五味姜辛湯治療慢性支氣管炎中起重要作用。見圖4。

圖3 交集基因互作網絡

圖4 PPI核心網絡篩選

2.7 GO富集分析與KEGG分析

應用R語言將交集基因進行GO富集分析與KEGG通路富集分析，并繪制相應氣泡圖。GO分析共獲得GO條目2 441條，其中生物過程(BP)主要條目為活性氧代謝過程(Reactive oxygen species metabolic process)、抗生素反應(Response to antibiotic)、細胞對氧化應激的反應(Cellular response to oxidative stress)、對細菌源分子的反應(Response to molecule of bacterial origin)、對脂多糖的反應(Response to lipopolysaccharide)、細胞對化學應激的反應(Cellular response to chemical stress)等。細胞組分(CC)主要條目為細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復合物(Cyclin-dependent protein kinase holoenzyme complex)、蛋白激酶復合物(Protein kinase complex)、轉錄調節復合物(Transcription regulator complex)等。分子功能(MF)主要條目為組蛋白激酶活性(Histone kinase activity)、核受體活性(Nuclear receptor activity)、蛋白磷酸酶結合(Protein phosphatase binding)等(見圖5)。KEGG信號通路富集分析共獲得165條，選取其中富集程度最高的30條通路，形成氣泡圖，其中，氣泡越大代表富集條目越多(見圖6)。主要信號通路為PI3K-Akt 信號通路、IL-17 信號通路、TNF信號通路等。

圖5 GO分析氣泡圖

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖

3 討論

慢性支氣管炎作為臨床常見病、多發病，其反復發作及遷延難愈的特點長期困擾醫患。而中醫藥治療慢性支氣管炎效果良好，在緩解臨床癥狀及疾病長期管理上優勢獨到。苓甘五味姜辛湯作為治療“咳嗽”“痰飲”的經典名方，應用廣泛，臨床療效較好。因此，采用網絡藥理學分析方法，挖掘苓甘五味姜辛湯治療機制，為臨床提供科學依據，具有重要意義。

3.1 中藥復方調控網絡

通過對中藥復方調控網絡的分析發現，其中主要化學成分為槲皮素、山奈酚、氨酚酸、β谷甾醇、茯苓酸A等。主要作用靶點為PTGS2、ESR1、AR、HSP90AB1、NOS2、PPARG、CDK2、ESR2、CCNA2、SCN5A等。槲皮素及山奈酚是甘草的活性成分，具有良好的抗炎作用，如李林蔓等[6]發現，槲皮素可通過調節Th17/Treg細胞平衡、HO-1表達而起到較好的抗炎作用，亦有報道[7]稱槲皮素可降低肺泡灌洗液及肺組織中IL-1β、TNF-α等炎性細胞因子水平，從而抑制香煙煙霧引起的氣道重塑。研究[8]表明，山柰酚具有明顯的抗炎作用，其作用機制主要包括調節促炎酶的活性及炎癥相關基因表達等。趙妍等[9]證實，山柰酚可減輕脂多糖導致的小鼠急性肺損傷，其機制可能是通過抑制多種促炎因子，如NF-κB、IL-1β、HO-1、PTGEs等 mRNA的表達，以及促進抗炎因子HO-1 mRNA的表達而發揮保護作用。β谷甾醇是一種植物甾醇，現代研究較少，但也有報道其具有抗菌、抗炎、抗真菌的作用[10]。嚴寧等[11]證實，β谷甾醇可通過調節IL-1β、IL-6及TNF-α水平，改善大鼠心肌缺血再灌注損傷的炎癥反應。茯苓酸A是茯苓的主要有效成分，具有抗氧化、抗炎的功效，秦劭晨等[12]研究發現，茯苓酸具有抑制TNF-α誘導SH-SY5Y的炎癥及氧化應激損傷作用。而在主要作用靶點中，PTGS2與慢性炎癥的發生、發展密切相關，前列腺素-內過氧化物合酶2(PTGS2)是通過產生炎癥介質前列腺素E2(PGE-2)從而起到調節炎癥的作用[13]。因此，可以推測苓甘五味姜辛湯治療慢性支氣管炎主要是發揮其抗炎、抗氧化及減輕損傷等方面作用。

3.2 PPI網絡及核心靶點

PPI核心網絡篩選主要結果為雌激素受體1(ESR1)、絲/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK14、MAPK1、MAPK8、MAPK3)、信號傳導和轉錄激活因子3(STAT3)、細胞周期蛋白D1(CCND1)、轉錄因子(JUN)等。STAT是一種轉錄調節因子，該信號參與了先天免疫、適應性免疫，急、慢性炎癥反應及腫瘤等疾病的發生[14]。STAT3作為傳導因子，可被各種刺激激活，從而在各種炎癥反應中起到信號轉導作用，研究[15]表明，IL-6結合受體后可活化JAK1，并促使STAT3的磷酸化和轉錄激活，最終調控T細胞的分化及炎癥反應。王月月等[16]證實，哮喘患者體內巨噬細胞向M2極化，協同共刺激分子B7-H3促進CD4+T細胞向Th2方向極化與巨噬細胞中STAT3表達增加相關。MAPK信號通路作為已知炎癥相關性信號通路，其由p38、ERK及JNK信號通路組成，是參與炎癥反應的主要組成部分[17]。劉茈蕊等[18]發現，大承氣湯可能通過調節p38 MAPK與ERK1/2這2條MAPK途徑磷酸化進程來抑制哮喘小鼠炎癥表達。周吉等[19]研究表明，使用P38 MAPK抑制劑可顯著減輕大鼠機械通氣相關肺損傷中炎癥因子、炎癥細胞的趨化。因此，STAT3及MAPK信號通路在慢性支氣管炎的發病過程中起著舉足輕重的作用。

3.3 苓甘五味姜辛湯治療慢性支氣管炎主要涉及的生物通路

通過KEGG通路富集分析后，得到的主要通路有PI3K-Akt 信號通路、IL-17 信號通路、Th17細胞分化、TNF信號通路、人巨細胞病毒感染、小細胞肺癌等。在慢性支氣管炎現代機制研究中，炎癥反應成為其核心機制，且存在黏液高分泌、氧化應激、氣道重塑等多種方式。結合慢性支氣管炎發病機制及富集通路，筆者推測苓甘五味姜辛湯主要通過緩解炎癥反應發揮其治療作用。在慢性支氣管的炎癥反應中，由多種炎癥因子廣泛參與，除較為常見的白介素-6、腫瘤壞死因子(TNF)外，由Th17細胞特異性分泌的白介素-17，可刺激支氣管上皮細胞釋放 IL-8 募集中性粒細胞，參與炎癥反應[20]。TNF可誘導細胞內多種信號通路，包括細胞凋亡、炎癥、免疫等，其激活后結合的受體TNFR2可激活NF-κB通路，包括PI3K依賴性NF-κB通路及JNK通路，與炎癥的發生、發展密切相關[21]。研究表明，PI3K/AKT/m TOR通路對Th17細胞具有積極的調控作用，KUREBAYASHI等[22]研究發現，通過PI3K/m TORC1抑制劑及敲除raptor，抑制AKT活性，進而影響了體外及體內Th17細胞分化，使IL-17A、IL-17F產生減少。而有研究[23]亦證實了PI3K信號通路與肺組織中嗜酸粒細胞増多、氣道黏液分泌增多、氣道高反應性的相關性。以上均提示，苓甘五味姜辛湯可能通過調節PI3K-Akt 信號通路(見圖7)、IL-17 信號通路、Th17細胞分化、TNF信號通路發揮抗炎、抗氧化、影響黏液分泌等作用，從而達到治療慢性支氣管炎的效果。此外，GO富集分析得出苓甘五味姜辛湯主要通過活性氧代謝過程、抗生素反應、細胞對氧化應激的反應、對脂多糖的反應等生物過程發揮治療作用。

圖7 PI3K-Akt 信號通路

綜上，本研究利用網絡藥理學方法，探討了苓甘五味姜辛湯治療慢性支氣管炎的作用機制，發現具有治療效果的主要成分為槲皮素、山奈酚、氨酚酸、β谷甾醇、茯苓酸A；主要作用靶點為ESR1、AKT1、CCND1、MAPK14、JUN、STAT3、MAPK1、NR3C1、MAPK3等。而根據GO富集分析及KEGG通路富集分析得出其主要通過活性氧代謝過程、抗生素反應、細胞對氧化應激的反應、對脂多糖的反應，以及通過PI3K-Akt 信號通路、IL-17 信號通路、Th17細胞分化、TNF信號通路等治療慢性支氣管炎。這些數據為臨床應用及相關研究提供了一定依據，但本研究仍存在不足，還需動物實驗加以驗證。