泥炭發酵產甲烷過程中古菌群落結構演替

郝思雯，馬力通,2*

(1.內蒙古科技大學化學與化工學院，內蒙古 包頭 014010；2.生物煤化工綜合利用內蒙古自治區工程研究中心，內蒙古 包頭 014010)

泥炭地是有泥炭賦存的地段，由于自然及人為因素的影響導致泥炭地退化，泥炭分解加劇，因此，搶救性開發退化泥炭地的泥炭資源具有重要的現實意義。泥炭是未完全腐敗分解的沼澤動植物殘體，在潮濕偏酸環境中經時間與壓力積累形成有機質礦體[1]，主要用于育苗基質和有機肥生產。泥炭通過厭氧發酵可直接轉化為生物甲烷[2-3]，實現泥炭資源就地轉化。但泥炭轉化存在甲烷產量較低的問題，高效穩定的微生物生態系統是厭氧發酵產甲烷的保證，是甲烷轉化反應體系穩定運行的關鍵，而微生物群落結構決定其生態系統功能，因此，深入解析微生物群落結構特征，是指導泥炭發酵產甲烷的關鍵。楊秀清等[4]研究了褐煤厭氧發酵過程中乙醇對微生物群落結構的影響，發現產甲烷古菌主要為甲烷桿菌屬(Methanobacterium)和甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)，其中甲烷八疊球菌屬相對豐度達60%，為褐煤厭氧發酵體系優勢古菌菌屬。賈璇等[5]研究了蘆葦厭氧聯產氫氣-甲烷過程中古菌群落結構特征，發現產氫階段優勢古菌為unculturedMethanosarcinalesarchaeon，產甲烷階段優勢古菌為Methanoculleusbourgensis。Han等[6]研究了青海高原沼氣池微生物群落結構，發現產甲烷古菌分屬于10個屬，其中產甲烷菌屬(Methanogenium，38.5%)為優勢菌屬。Ciccoli等[7]研究了菊芋厭氧發酵產甲烷的產量和微生物群落結構，發現風干菊芋發酵產甲烷的產量較高，優勢菌屬為甲烷囊菌屬(Methanoculleus)。以上關于發酵產甲烷過程微生物群落結構演替的文獻報道涉及不同原料，但目前未見涉及泥炭的研究。鑒于此，作者以草本泥炭為原料進行厭氧發酵，利用多聚酶鏈式反應(PCR)-變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術對泥炭發酵產甲烷過程中古菌群落結構特征進行分析，為進一步改進泥炭發酵產甲烷工藝、提高甲烷產量、促進泥炭生物轉化提供理論基礎。

1 實驗

1.1 材料

活性污泥，采自包頭市南郊污水處理廠，經厭氧馴化后儲存于4 ℃冰箱中；草本泥炭，購自吉林省敦化市。

1.2 方法

1.2.1 泥炭發酵產甲烷

采用AMPTS Ⅱ型全自動甲烷潛力測試系統進行泥炭發酵產甲烷實驗。將40 g粉碎至粒徑為150 μm(100目)的草本泥炭和200 mL活性污泥置于發酵瓶中，調節初始pH值為7.0，加蒸餾水至發酵總體積為400 mL，充氮氣120 s(提供厭氧條件)，發酵溫度35 ℃。在發酵過程中，通過電機自動控制攪拌時間1 min，每次間隔30 min。在發酵第1 d、第6 d、第12 d、第18 d、第24 d取樣，編號分別為S-1、S-6、S-12、S-18、S-24。

1.2.2 DNA提取

采用改良CTAB法提取樣品基因組DNA。

1.2.3 PCR擴增

以樣品基因組DNA為模板，進行巢式PCR擴增：首先采用引物Arch21F：5′-TTCCGGTTGATCCYGCCGGA-3′，1492r：5′-GGCTACCTTGTTACGA CTT-3′對樣品進行PCR擴增；然后采用引物1106f-GC/1378r對產甲烷古菌進行PCR擴增。

1.2.4 PCR擴增產物的DGGE分析

取10 μL PCR擴增產物進行DGGE分析。變性梯度為32%～62%，采用8%聚丙烯酰胺凝膠，在1×TAE緩沖液中于85 V、60 ℃下電泳16 h。

1.2.5 DGGE優勢條帶的回收、測序與分析

用滅菌的手術刀切下DGGE優勢條帶，回收后，以2 μL回收產物為模板、1106f-GC/1378r為引物進行PCR擴增。

將重新擴增的DNA片段切膠回收、純化后，連接到pMD18-T載體上，并轉化至DH5α感受態細胞中，篩選陽性克隆，進行序列測定。

采用Quantity One軟件對DGGE圖譜中條帶數目、條帶灰度進行數字化分析，采用Canoco軟件進行主成分分析(PCA)。采用DNAstar和Cluster軟件對測序結果進行分析，下載最相似的菌株序列作為系統發育樹的參考序列。采用MEGA軟件，通過Neighbor-Joining法構建系統發育樹，自展數(bootstrap)為1 000。

2 結果與討論

2.1 PCR擴增結果

以樣品基因組DNA為模板，進行巢式PCR擴增，5種樣品PCR擴增產物的DGGE圖譜(圖1)均顯示得到約350 bp的DNA片段，擴增效果良好，可進行DGGE分析。

圖1 5種樣品PCR擴增產物的DGGE圖譜Fig.1 DGGE profile of PCR amplification products of five samples

2.2 PCR擴增產物的DGGE分析及多樣性分析

DGGE只能對菌群數量大于1%的微生物群落進行分析，DGGE圖譜中的條帶灰度、數目和位置代表微生物群落菌群的豐度及多樣性，條帶的出現或消失說明相應的菌群可能發生變化[8]。對5種樣品PCR擴增產物進行DGGE分析，利用Quantity One軟件繪制對應的模式圖，結果如圖2所示。

圖2 5種樣品PCR擴增產物的DGGE圖譜及其對應的模式圖Fig.2 DGGE profile of PCR amplification products of five samples and corresponding pattern diagram

由圖2可知，DGGE圖譜條帶清晰，表明PCR擴增結果得到預期效果。5種樣品(不同發酵時期)產甲烷古菌菌群條帶數目、位置及灰度存在差異：發酵初期條帶數目較多，但條帶灰度較低，表明發酵初期古菌菌群豐富，具有多樣性，但菌群豐度較低；隨著發酵的進行，條帶3、4、11、13的灰度逐漸升高，而條帶1、2、7、12的灰度逐漸降低甚至消失，其余條帶則始終維持較高灰度，未受發酵進程影響。不同發酵時期DGGE圖譜有許多相同條帶，如條帶2、4、6、8、9、10，這些條帶對應的古菌為整個發酵進程共有，而一些條帶只在特定時期出現，為某發酵時期特征條帶，如條帶1、5、7為發酵初期特征條帶，條帶14為發酵末期特征條帶。以上表明，隨著泥炭發酵產甲烷的進行，產甲烷古菌群落結構發生了演替。

DGGE圖譜中的條帶灰度代表微生物豐度。從5種樣品DGGE圖譜條帶灰度(表1)可知，在發酵初期，條帶8的灰度最高(232.93)，表明此古菌豐度最高，為產甲烷優勢古菌；隨著發酵的進行，優勢古菌及其豐度發生改變，發酵6 d時條帶9的灰度最高(235.37)，發酵18 d時條帶8的灰度又達到最高(236.70)，發酵末期條帶8的灰度仍維持最高。表明在泥炭發酵產甲烷進程中優勢古菌發生了演替。

表1 5種樣品DGGE圖譜條帶灰度

對5種樣品DGGE圖譜進行分析，得到泥炭發酵產甲烷過程中古菌群落結構特征指數，見表2。

表2 泥炭發酵產甲烷過程中古菌群落結構特征指數

由表2可知，泥炭發酵產甲烷過程中，古菌群落結構特征指數(香農指數、均一度指數和豐富度指數)雖有差異，但變化趨勢相同，均在發酵18 d時達到最大值，香農指數為2.393 4，均一度指數為0.998 1，豐富度指數為11。5種樣品(不同發酵時期)的豐富度指數均達到或超過9，表明泥炭發酵產甲烷過程中古菌菌群豐富，其中樣品S-18(發酵第18 d)的豐富度指數達到11，表明發酵18 d時古菌群落含有11種產甲烷古菌，其群落多樣性高于其它時期[9]。

2.3 不同發酵時期泥炭產甲烷古菌群落結構相似性分析

依據PCR-DGGE圖譜，分析5種樣品(不同發酵時期)古菌群落結構的相似性，結果見表3。

表3 5種樣品古菌群落結構的相似性

由表3可知，泥炭發酵產甲烷初期與其它時期產甲烷古菌群落結構存在較大差異，其中發酵初期(第1 d)與發酵末期(第24 d)時的古菌群落結構差異最大，相似性最低，僅為0.50；發酵第6 d與第12 d時的古菌群落結構基本相似，相似性達0.88；發酵第18 d與第12 d時的古菌群落結構相似性較高，達0.85；發酵第24 d與第18 d時的古菌群落結構相似性達0.80。

泥炭發酵產甲烷古菌的聚類分析(圖3)表明：發酵第6 d與第12 d時的古菌群落結構相似度高達0.88；而發酵第18 d與第12 d、第6 d時的古菌群落結構相似度降為0.81；發酵第24 d與第18 d、第12 d、第6 d時的古菌群落結構相似度又有所下降，降至0.77；發酵第1 d與其它發酵時期的古菌群落結構相似度最低，為0.65。泥炭發酵產甲烷古菌的主成分分析(圖4)表明：發酵第12 d和第24 d時的古菌群落結構相似，發酵初期與其它發酵時期的古菌群落結構差異明顯。以上表明，隨著泥炭發酵產甲烷的進行，產甲烷古菌群落結構發生了演替。

圖3 泥炭發酵產甲烷古菌的聚類分析Fig.3 Cluster analysis of archaea in methanogenesis with peat

圖4 泥炭發酵產甲烷古菌的主成分分析Fig.4 PCA of archaea in methanogenesis with peat

2.4 DGGE圖譜條帶的序列比對

對圖2中具代表性的14個條帶進行克隆測序，并與GenBank數據庫中的已有序列進行比對分析，得到泥炭發酵產甲烷過程中古菌群落結構的同源性信息(表4)，并構建系統發育樹(圖5)。

由表4和圖5可知，泥炭發酵產甲烷過程中古菌群落結構具有多樣性，各條帶序列與近緣種的相似度為0.84～1.00，條帶4、9最相似菌株為Methanosaetaharundinacea，條帶7、8、11最相似菌株為Methanosaetaconcilii，條帶10、12、13、14最相似菌株為Methanolineatarda，條帶3最相似菌株為Methanobacteriumbeijingense，條帶6最相似菌株為Methanobacteriumsubterraneum，條帶1、2、5最相似菌株為Methanobrevibacterruminantium。 產甲烷古菌均屬于廣古菌門(Euryarchaeota)，分屬于3個古菌菌目，包括甲烷八疊球菌目(Methanosarcinales)、甲烷桿菌目(Methanobacteriales)和甲烷微菌目(Methanomicrobiales)，分屬于4個古菌菌屬，包括甲烷鬃菌屬(Methanosaeta)、甲烷繩菌屬(Methanolinea)、甲烷桿菌屬(Methanobacterium)和甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)，其中甲烷鬃菌屬為泥炭發酵產甲烷過程中的優勢菌屬。

表4 泥炭發酵產甲烷過程中古菌群落結構的同源性信息

圖5 泥炭發酵產甲烷古菌的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of archaea in methanogenesis with peat

2.5 泥炭發酵產甲烷過程中古菌群落結構演替

從泥炭發酵產甲烷過程中的古菌菌群相對豐度(圖6)可知，隨著泥炭發酵產甲烷的進行，古菌群落結構發生變化，其中甲烷鬃菌屬(Methanosaeta)的相對豐度呈先升高后降低的趨勢，維持在36.37%～50.00%之間，是泥炭發酵產甲烷過程中的優勢菌屬；甲烷繩菌屬(Methanolinea)的相對豐度由20.00%逐漸升至30.00%；甲烷桿菌屬(Methanobacterium)的相對豐度先升高后趨于穩定，發酵末期相對豐度為20.00%；而甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)的相對豐度由30.00%降至10.00%。表明泥炭發酵產甲烷過程中古菌群落結構發生了演替。

圖6 泥炭發酵產甲烷過程中的古菌菌群相對豐度Fig.6 Relative abundance of archaea in methanogenesis with peat

泥炭富含有機質，有機質厭氧降解產生短鏈脂肪酸(VFA)、H2/CO2和各種醇類化合物，產甲烷古菌可以利用系統中的乙酸及H2/CO2轉化產甲烷，保證有機質厭氧降解持續穩定進行[10-11]。其中優勢菌屬甲烷鬃菌屬只利用乙酸產甲烷，是專性乙酸營養型產甲烷古菌，常見于厭氧反應器和湖底沉積物微生物群落中[12-13]；甲烷繩菌屬和甲烷桿菌屬均利用H2/CO2生長，為氫營養型產甲烷古菌，常見于厭氧反應器、水稻田、凍土層、淡水和海洋沉積物微生物群落中[14-17]；甲烷短桿菌屬利用H2/CO2生長，為氫營養型產甲烷古菌，常見于哺乳動物糞便、白蟻腸道和厭氧反應器中[18-19]。

2.6 不同原料發酵產甲烷過程中的優勢古菌分析(表5)

表5 不同原料發酵產甲烷過程中的優勢古菌分析

由表5可知，發酵原料不同，產甲烷過程中的優勢菌屬不同，產甲烷途徑也存在差異。當發酵原料為秸稈[20]時，優勢菌屬為甲烷八疊球菌屬，屬于氫營養型、甲基營養型和乙酸營養型混合古菌，可利用H2/CO2、甲基類化合物、乙酸底物轉化生成甲烷[11]；當發酵原料為牛糞[21]時，優勢菌屬為甲烷囊菌屬，屬于氫營養型古菌，可利用H2/CO2、甲酸轉化生成甲烷[11]；當發酵原料為雞糞[22]時，優勢菌屬為產甲烷菌屬，屬于氫營養型古菌；當發酵原料為褐煤[23]時，優勢菌屬為甲烷卵圓形菌屬(Methanocalculus)，屬于氫營養型古菌，可利用H2/CO2、甲酸轉化生成甲烷；本研究以泥炭為發酵原料，優勢菌屬為甲烷鬃菌屬，是專性乙酸營養型產甲烷古菌，只能利用乙酸產甲烷，將乙酸分子的甲基轉化為甲烷[24]。甲烷繩菌屬、甲烷桿菌屬和甲烷短桿菌屬屬于氫營養型產甲烷古菌，通過CO2還原途徑產甲烷，以H2作為電子供體，通過氫酶作用還原CO2，進而轉化生成甲烷[25]。泥炭發酵產甲烷過程中的優勢菌屬為甲烷鬃菌屬，與其它發酵基質產甲烷古菌優勢菌屬不同，泥炭發酵產甲烷的途徑主要為乙酸營養型代謝類型，同時伴隨氫營養型代謝類型。

3 結論

泥炭發酵產甲烷過程中的古菌菌群均屬于廣古菌門，包括甲烷鬃菌屬、甲烷繩菌屬、甲烷桿菌屬和甲烷短桿菌屬，其中甲烷鬃菌屬為優勢菌屬；研究泥炭發酵產甲烷過程古菌群落結構有利于進一步改進泥炭發酵產甲烷工藝，提高甲烷產量，促進泥炭就地轉化。

在泥炭發酵產甲烷過程中，古菌菌群的豐度發生波動。隨著發酵的進行，甲烷鬃菌屬的相對豐度最高，維持在36.37%～50.00%之間，甲烷繩菌屬和甲烷桿菌屬的相對豐度分別升至30.00%和20.00%，而甲烷短桿菌屬的相對豐度逐漸降低，發酵末期僅為10.00%。泥炭發酵產甲烷過程實質上是多種古菌菌群的物質代謝和能量代謝過程，對古菌群落結構演替的認知有助于構建出可以服務于生物甲烷工業生產的人工混合菌群，通過調節環境條件中的溫度、pH值等參數，有效協調菌群間的關系，使其達最佳生態水平，發揮泥炭轉化甲烷最大效應。

泥炭發酵產甲烷途徑主要為乙酸營養型代謝類型，同時伴隨氫營養型代謝類型。甲烷鬃菌屬為優勢古菌，是專性乙酸營養型產甲烷古菌，只利用乙酸產甲烷；甲烷繩菌屬、甲烷桿菌屬和甲烷短桿菌屬屬于氫營養型產甲烷古菌，利用H2/CO2轉化生成甲烷。不產甲烷微生物群落結構的動態演替及其與產甲烷古菌群落之間的協同作用機理有待進一步深入研究。