發酵過程中南瓜汁揮發性成分的變化

彭興興，郭巧云，楊土琳

（1.江門職業技術學院，廣東 江門 529030；2.廣東省綠色高性能新材料研發工程技術研究中心，廣東 江門 529030）

南瓜是一種常見的蔬菜，種植范圍廣，全國各地都有栽培。南瓜營養豐富，含有人體所需的各種氨基酸、多糖、類胡蘿卜素、礦質元素等營養物質，具有輔助降血脂、輔助降血糖、抗腫瘤、抗氧化等多種藥用價值[1-4]。根據FAOSTAT數據庫，2014年我國南瓜總產量超過3 000萬噸，生產面積110萬公頃，南瓜資源十分豐富[5]，但南瓜產品形式單一、加工產業處于下游，附加值低。乳酸菌廣泛存在于自然界中，是一類可以利用碳水化合物發酵產生大量乳酸的細菌總稱[6]。乳酸菌具有調節胃腸道菌群平衡，改善人體消化吸收系統，降低膽固醇等生物保健功能[7-10]。現今，發酵果蔬汁飲料發展迅猛[11-12]，已有多款同類產品上市，并且深得廣大消費者青睞。因此，開發功能性乳酸菌發酵相關的南瓜飲品，不僅可以提高南瓜的精深加工附加值，而且可以促進南瓜行業發展，改變南瓜加工的初級階段地位。風味一直是構成食品品質最重要的因素之一，也是其能否為廣大消費者所接受的關鍵因素。通過利用原料當中的營養物質，乳酸菌可以改變果蔬汁的風味組成結構，生成揮發性成分和滋味物質，從而影響到產品的風味和口感[13-14]。現今對發酵南瓜汁的研究多集中于菌種篩選[15]和工藝優化[16]，對發酵過程中揮發性風味物質的變化探究較少。

該文選用瑞士乳桿菌[17]作為發酵菌種，使用氣質聯用技術（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS），測定南瓜汁發酵前后揮發性風味物質的變化，探究乳酸菌對南瓜風味感官品質產生的影響及其內在變化規律，為生產高品質的乳酸菌發酵南瓜汁的生產提供一定技術支持和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南瓜：市售；瑞士乳桿菌菌粉：丹尼斯克公司；NaCl（分析純）：廣州化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；PYX-DHS隔水式保溫箱：上海博泰實驗設備有限公司；75 μm CAR/PDMS微萃取頭：美國Supelco公司；DSQ II氣相色譜-質譜聯用儀：美國Thermo公司；WH-2微型渦流混合儀：上海瀘西分析儀器廠；yp202n型電子天平：上海精密儀器儀表公司；榨汁機：九陽股份有限公司；pHS-25型pH計：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 南瓜汁的制備

選擇成熟度合適、無明顯缺陷的南瓜。將清洗好的南瓜先去皮和去囊處理，后切成小細塊備用，按照南瓜∶水（質量比）=1∶1的比例，將稱好的南瓜放入榨汁機中，加水后榨汁，分裝于干凈的錐形瓶中，密封保存，將南瓜汁快速加熱至90℃，滅菌10 min后，冷卻至室溫備用。

1.3.2 樣品制備

接種瑞士乳桿菌，以106cfu/mL的接種量加入殺菌南瓜汁中[6]，在37℃恒溫條件下靜置發酵48 h，每隔12 h（0、12、24、36、48 h）準確移取發酵液 10 mL 于進樣瓶中，各加入1.0 gNaCl，密封后上機進行檢測。

1.3.3 理化指標測定

pH值采用pHS-25型pH計進行測定；可滴定酸度的測定參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》；乳桿菌活菌數的測定參考GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》，采用稀釋平板計數法測定；還原糖的測定參考GB 5009.7—2016《食品安全國家標準食品中還原糖的測定》，采用直接滴定法；每個樣品平行測定3次。

1.3.4 GC-MS測定條件

GC條件：TR-5MS彈性石英毛細色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度 250℃，載氣為高純度氦氣（純度 99.999%，流速 1.0 mL/min），分流比 10∶1。升溫程序條件：起始溫度45℃，保留2 min，以5℃/min升到150℃，保持1 min，再以10℃/min升至220℃，保持5 min。

MS條件：電子轟擊電離（EI）離子源，電子能量70 eV；電子倍增器電壓350 V；離子源溫度230℃；傳輸線溫度250℃；質量掃描范圍為質荷比35～500。

1.3.5 感官評定

感官評價對樣品的總體接受度、氣味、口味進行評分，由10名專業人員對每項指標進行打分，最終評分結果取平均值，評分標準見表1。

表1 感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standards

1.3.6 數據分析

試驗數據采用Origin9.0軟件處理分析。揮發性風味物質的鑒定根據NIST14數據庫進行檢索，結合相關資料，選擇匹配度大于85的物質作為有效的揮發性成分[18]，按照峰面積歸一化法進行相對定量，計算各揮發性化合物的相對百分含量。

2 結果與分析

2.1 瑞士乳桿菌在南瓜汁中生長代謝情況

發酵過程中南瓜汁的指標變化見圖1。

圖1 發酵過程中南瓜汁的指標變化Fig.1 The index change of pumpkin juice during fermentation

圖1反映了瑞士乳桿菌在南瓜汁中的生長情況，發酵至12 h時，pH值由最初的6.5下降至4.2，活菌數由初始的6.0 lgcfu/mL增加至8.4 lgcfu/mL，能夠比較好的適應南瓜汁發酵，pH值的下降和活菌數的變化呈現一種對應關系。多糖和葡萄糖是南瓜的主要糖類物質，瑞士乳桿菌在南瓜汁中代謝增殖，利用南瓜內的葡萄糖、氨基酸等營養物質發酵產生乳酸等代謝產物，使其總酸含量增加、總糖含量下降，影響到糖酸比，表現出酸味。有研究表明南瓜在發酵過程中大部分活性多糖成分能被保留[19]。酸度和還原糖含量變化與前面南瓜汁中pH值和活菌數的變化情況相呼應，這與盧嘉懿等[20]研究植物乳桿菌發酵不同果蔬汁中的結論相一致。

2.2 瑞士乳桿菌發酵南瓜汁揮發性成分變化

通過 GC-MS 氣質聯用技術對 0、12、24、36、48 h發酵南瓜汁的揮發性物質進行檢測和分析，根據圖譜檢索，發酵過程中南瓜汁的揮發性成分物質鑒定結果，如表2所示。

表2 發酵過程中南瓜汁揮發性成分相對含量Table 2 Volatile component relative content of pumpkin juice during fermentation

續表2 發酵過程中南瓜汁揮發性成分相對含量Continue table 2 Volatile component relative content of pumpkin juice during fermentation

續表2 發酵過程中南瓜汁揮發性成分相對含量Continue table 2 Volatile component relative content of pumpkin juice during fermentation

由表2可知，南瓜汁的揮發性物質鑒定出29種化合物，南瓜汁中主要揮發性物質有己醛、2-甲基丁醛、2，4-二叔丁基苯酚、1-戊醇和1-己醇，含量依次為12.72%、6.61%、6.17%、4.93%和4.04%。羰基化合物是南瓜汁中揮發性成分含量最高的一類，總共占28.7%，相對含量第二高的是醇類物質。李瑜[21]在研究酶解后南瓜汁揮發性成分時也有類似結果。一般來說，鏈狀的醇、醛、酮、酸、酯等化合物，在低分子量范圍內由于揮發性強，官能團的比重大，官能團特有的氣味也較強烈。隨著分子碳鏈的增長，其氣味也由果實香型→清香型→脂肪臭型的方向變化，而且氣味的持續性也隨著增強。通常低級飽和醇和醛C1-C10范圍內具有令人愉快的氣味，低級飽和酮具有特殊香氣，低級飽和羧酸一般都有不愉快的嗅感，酯類物質大多具有水果香味，芳香族化合物都有其特殊的嗅感。比如，己醛具有清香和果香味、丁醇和戊醇有醉人的香氣、壬醇有芳香味，丙酮有薄荷味。南瓜汁中己醛、2-甲基丁醛、1-戊醇、1-己醇的含量占28.30%，可能是賦予南瓜清香的主要原因。發酵南瓜汁揮發性物質的變化見圖2。

圖2 發酵南瓜汁揮發性物質的變化Fig.2 The changes of volatile compound in fermented pumpkin juice

由圖2可以看出，經瑞士乳桿菌發酵后，南瓜汁揮發性物質種類和含量均增加，不同發酵時間其各類物質含量存在差異。由表2知發酵南瓜汁共有相同成分34種，主要是3-羥基-2-丁酮、2，3-丁二酮和丙酮。與未發酵的南瓜汁相比，共有相同成分11種，這說明瑞士乳桿菌對南瓜汁風味物質的變化是有影響的。

羰基化合物是發酵南瓜汁的主要風味物質，含量最高的揮發性成分是3-羥基-2-丁酮，是南瓜汁的主要特征香氣成分[22]。發酵過程中，南瓜汁中酮類物質占比迅速增加，至發酵36 h達最大值，特別是以乳酸菌發酵所特有的3-羥基-2-丁酮、2，3-丁二酮和丙酮的增加量最為明顯。與此相對的是醛類占比呈下降趨勢，特別是己醛占比大量減少，至發酵36 h后，未再檢測到該物質，但整個發酵過程中，醛類的種類是相對增加的。有研究報告醛、酮的產生與乳酸菌代謝氨基酸和糖類有關[23-24]，其中 3-羥基-2-丁酮、2，3-丁二酮具有清香氣味。

相比未發酵南瓜汁，發酵后的南瓜汁醇和酚類物質大幅下降，醇和酚類含量的變化可能與菌種以及菌內胞內酶有關。發酵后丁醇和環丁醇消失不見，轉而產生新的（E）-2-壬烯-1-醇、1，9-壬二醇，新增的不飽和醇往往比飽和醇具有更強烈的風味。另外，發酵后醇的種類略有增多，發酵0 h時為6種，12 h時有8種，最后又變為6種。發酵12 h之后，隨著發酵時間的延長，醇類含量呈上升趨勢，從2.93%上升至3.95%，而酚類物質有下降的趨勢，這可能是瑞士乳桿菌存在某種能分解酚類物質的酶，使之轉化成其他物質而減少。

酯類物質是一類影響風味物質重要化合物，通常酯類的生成是由醇和酸發生反應轉化而來的，也可以由微生物代謝脂類物質得到，如QIN等[25]研究發現脂肪酸是梨中多種水果香味的前體物質。發酵南瓜汁酯類物質種類和含量均有不同程度的增加，這與發酵過程中醇類含量下降相對應。0 h時有2種，占比1.23%；12 h時有6種，占比6.96%；24 h時有5種，占比7.97%；36 h時有5種，占比6.51%；48 h時有5種，占比5.31%。新增加的酯類物質主要有丙酸乙酯、辛酸乙酯，盡管某些酯類的含量相對較低，但對南瓜汁風味的改變影響甚大，有時起關鍵作用。

發酵南瓜汁酸類含量明顯增多，隨著發酵時間的延長，逐漸遞增。由0 h時的1.94%，到24 h時的4.19%，再到36 h時的5.72%，最后增至48 h時的8.12%，增加的酸類物質主要是乙酸，這與發酵過程中乳酸菌大量增殖，不斷消耗葡萄糖，累積代謝生成乙酸有關。

對于芳香族化合物來說，苯的氣味不好聞，但在苯環上引入烴基后，其嗅感就會發生變化，如甲基異丙苯具有胡蘿卜氣味，在發酵南瓜汁中檢測到甲苯和1，4-二甲苯。發酵后，南瓜汁中烷烴類含量和種類均變少，其閾值相對較高，變化與脂肪代謝相關。此外，在南瓜汁中還發現有2-戊基呋喃和β-環檸檬醛，這可能與南瓜發生美拉德反應和類胡蘿卜素降解反應有關。

2.3 瑞士乳桿菌發酵南瓜汁感官評定變化

瑞士乳桿菌發酵南瓜汁感官評價見圖3。

圖3 瑞士乳桿菌發酵南瓜汁感官評價Fig.3 Sensory evaluation of pumpkin juice fermented by Lactobacillus helveticus

瑞士乳桿菌消耗南瓜汁中的糖類、氨基酸等物質進行代謝生成酸類、酮類、酯類等風味物質，使得南瓜汁甜味逐步下降，酸味開始增加。發酵0 h時，南瓜汁有一股蒸煮味，掩蓋了南瓜的清香味；發酵12 h時，瑞士乳桿菌在南瓜汁中大量增殖，南瓜汁中風味物質在發酵12 h后開始迅速累積，酮類、酯類物質增加，香味增強，酸度適口，使得南瓜汁在發酵12 h時各項評分最高；發酵24 h后，由于酸類、酮類物質含量過高，使得南瓜汁整體氣味不協調，具有刺激性，令人不愉快，總體可接受度變低。

3 結論

本研究通過GC-MS氣質聯用技術，從發酵0、12、24、36、48 h 的南瓜汁中分別鑒定出 29、44、44、40、38種揮發性物質，相同的揮發性物質有11種，經瑞士乳桿菌發酵后，其風味物質種類和含量均增多，顯著影響了南瓜汁風味的改變，且發酵時間不同，揮發性物質種類和含量存在差異。未發酵時南瓜汁的主要揮發性成分是己醛、2-甲基丁醛、2，4-二叔丁基苯酚、1-戊醇、1-己醇；發酵后南瓜汁的主要揮發性成分是3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二酮、丙酮、乙酸、丙酸乙酯等物質。瑞士乳桿菌傾向于將南瓜汁中的醛類和醇類物質轉化成酮類和酸類物質。發酵12 h時南瓜汁感官評分最高，發酵時間的控制對南瓜汁風味影響較大，這為發酵南瓜汁飲料工藝優化提供一定參考價值。