綠豆漿復合菌種發酵工藝條件的研究

江光熙，高 福，陳 蕓，趙思明

(1.湖北省公安縣公共檢驗檢測中心，湖北 荊州 434300； 2.江蘇微康生物科技有限公司，江蘇 蘇州 215200； 3.華中農業大學食品科技學院，湖北 武漢 430070)

綠豆是我國常見的豆類之一，其營養豐富，具有良好的食用價值和藥用價值。中醫認為，綠豆味甘性寒，可以清熱解毒，消暑利水[1]。現代研究表明，綠豆具有抗菌抑菌[2]、降血糖[3]、降血脂[4]、抗腫瘤[5]、抗氧化[6]、提高免疫力等功效[7]。新近研究發現，食用綠豆可有效緩解高脂飲食小鼠的體重增加和脂質代謝紊亂，并調節腸道微生物區系的結構[8]。綠豆經萌發后其營養組成發生改變，容易被人體吸收，同時該過程還可富集酚類、異黃酮和γ-氨基丁酸等對人體有生理功能的活性物質，減少或消除抗營養因子[9-12]。

隨著人們健康意識逐漸增強，消費觀念隨之轉變。谷物飲料因具有天然、綠色、營養、健康的特點，符合飲料市場發展潮流和趨勢，從而受到越來越多人的青睞。益生菌發酵不僅可以改善產品的風味、口感等，還可以促使結合態活性成分的釋放，從而發揮更好的營養和健康效益[13-15]。我們以萌發的綠豆為原料，利用課題組篩選的卡斯特酒香酵母和植物乳酸桿菌對其進行發酵，主要研究復合菌種發酵工藝條件對綠豆漿品質的影響，以期為發酵綠豆漿的開發提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠豆，中綠1號，購于湖北省種子管理局商業中心；卡斯特酒香酵母(Brettanomycescustersii)ZSM-001(專利號：ZL2007100536112)和植物乳酸桿菌(Bourdichonplantarum)ZSM-002(專利號：ZL2009100638581)均由中國典型培養物保藏中心提供。

LRH-150B型生化培養箱，廣東省醫療器械；HD-1360型水平流超凈工作臺，哈爾濱東聯儀器公司；722S型可見光分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；TDL-S-A型臺式離心機，上海菲恰爾分析儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1試驗用菌種的制備

取冷藏的酵母和乳酸菌株，在無菌操作臺中分別從斜面中取2～3環接種到土豆液體培養基和MRS液體培養基中30℃下培養24 h，其中酵母菌在搖床中培養。液體培養結束后，分別從液體培養基中鉤出1環接種到相應的固體平板中，在30℃下培養48 h使菌活化。取活化菌種2～3環接種到相應的液體培養基中，在30℃下培養48 h，其中酵母菌在搖床中培養。培養結束后，將菌液在4 000 r/min下離心5 min，離心結束后倒去培養液，收集菌泥(乳酸菌水分約為72.3%，酵母菌水分約為66.7%)備用。

1.2.2發酵綠豆漿的制備

稱取一定量無破損綠豆，用自來水沖洗干凈后用0.1%的次氯酸鈉浸泡10 min進行消毒，再用自來水沖洗干凈，加入3倍體積的硫酸鋅溶液(濃度150 mg/L)浸泡5 h，瀝干后置于已消毒的發芽器中發芽16 h (發芽溫度25℃，濕度90%～99%)，發芽結束后用蒸餾水清洗2次，按照液豆重量比1∶2加入營養液(10 mmol/LL-谷氨酸鈉，0.2 mmol/L CaCl2)，用碎冰機磨漿2 min。將經過2次活化2次擴大培養的ZSM-001酵母菌與ZSM-002植物乳酸菌按照一定比例和添加量加入到綠豆漿中于一定溫度下發酵。

1.2.3發酵條件的優化

1.2.3.1單因素試驗

分別研究乳酸菌和酵母菌菌種比例、接種量、糖添加量、發酵時間、發酵溫度對綠豆漿感官品質的影響。

1.2.3.2正交試驗

根據上述單因素試驗結果，以復合菌比例、接種量、加糖量、發酵時間、發酵溫度為因素，選取4個水平，以發酵綠豆漿的pH值、酸度、GABA含量、植酸含量、感官評定為指標進行五因素四水L16(45)正交試驗，確定最佳發酵條件。

1.2.4品質評價指標的測定

1.2.4.1感官評定

由5位食品專業人員組成感官評定小組，對綠豆漿的組織狀態、色澤、氣味分別進行評價后再對綠豆漿進行綜合評定，感官評定標準見表1。

表1 發酵綠豆漿感官評定標準

1.2.4.2酸度的測定

稱取攪拌均勻樣品5.0 g于150 ml三角瓶中，加入 40 ml 新煮沸并已冷卻至約 40℃的蒸餾水混勻，再加入5滴酚酞指示劑，用濃度為0.1 mol/L氫氧化鈉滴定至微紅色，30 s內不消失為滴定終點，記錄消耗氫氧化鈉體積V。酸度=V×20(°T)。

1.2.4.3GABA含量的測定

稱取綠豆5.0 g加水研磨后定容至50 ml。于30℃下水浴浸提2 h后4 000 r/min離心10 min，用0.25 μm微孔過濾膜過濾，取濾液0.6 ml于25 ml，加入0.2 ml 0.2 mol/L硼酸-硼酸鈉緩沖液(pH9.0)，1 ml 6%苯酚溶液，0.4 ml次氯酸鈉(活性氯質量分數5.25%)，振蕩沸水浴10 min后立即冰水浴20 min(有藍綠色化合物出現)，加入2 ml 60%乙醇溶液于645 nm下比色，測吸光值。根據吸光度查標準曲線，求出樣品中GABA含量。標準曲線是通過配制0,0.025、 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/ml的GABA標準溶液，按照上述方法測定其吸光度，以濃度為橫坐標x，以吸光度為縱坐標y繪制的標準曲線回歸方程為：y=3.986 3x-0.017 7(R2=0.995 6)。

1.2.4.4植酸的測定

采用GB/T 5009.153—2016的方法測定。

1.2.5數據處理

采用Excel 軟件和SAS V8軟件進行數據處理和分析，顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1復合菌種比對綠豆漿感官品質的影響

復合菌種比對發酵綠豆漿感官品質的影響見表2。

表2 復合菌種比對發酵綠豆漿感官品質的影響

由表2可知，復合菌種比對發酵綠豆漿的組織狀態和色澤無顯著影響，對發酵綠豆漿的氣味和綜合評分有顯著影響。在乳酸菌∶酵母菌為2∶3時，發酵綠豆漿的綜合評分和氣味評分均最高，在菌種比為1∶0時最低。隨著乳酸菌含量的減少、酵母菌含量的增大，氣味和綜合評分呈先增大后減小趨勢，這可能是因為乳酸菌產生的乳酸與綠豆漿中的揮發性物質混合使綠豆漿產生異味，而酵母菌利用中鏈脂肪酸及脂類氧化產物產生的醇類、酸類物質具有果香味，使綠豆漿具有良好發酵氣味；但酵母菌添加量過大時，又使綠豆漿產生異味，導致評分降低。適宜的乳酸菌與酵母菌比例為2∶3～1∶2。

2.1.2接種量對發酵綠豆漿感官品質的影響

接種量對發酵綠豆漿感官品質的影響見表3。

表3 接種量對發酵綠豆漿感官品質的影響

由表3可知，接種量對發酵綠豆漿的色澤無顯著影響，但對發酵綠豆漿的組織狀態、氣味和綜合評分有不同程度的影響。隨著接種量增加，綠豆漿發酵氣孔越來越密集，其組織狀態評分增高。發酵綠豆漿的氣味和綜合評分隨著接種量增加呈先升高后降低的趨勢，在總接種量為0.6%時，兩者評分最高。適宜的接種量為0.2%～1.4%。

2.1.3加糖量對發酵綠豆漿感官品質的影響

接種量對發酵綠豆漿感官品質的影響見表4。

表4 糖添加量對發酵綠豆漿感官品質的影響

由表4可知，加糖量對發酵綠豆漿的色澤無顯著影響，對發酵綠豆漿的組織狀態、氣味和綜合評分有不同影響。隨著加糖量的增加，發酵綠豆漿的組織狀態評分逐漸升高，氣味和綜合評分呈先升高后降低的趨勢，在加糖量為3%時，氣味和綜合評分達到最大值。適宜的加糖量范圍為3%～5%。

2.1.4發酵時間對發酵綠豆漿感官品質的影響

發酵時間對發酵綠豆漿感官品質的影響見表5。

表5 發酵時間對發酵綠豆漿感官品質的影響

由表5可知，隨著發酵時間的延長，綠豆漿組織狀態評分逐漸升高，氣味和綜合評分均先升高后降低，在發酵4 h時，氣味評分和綜合評分均最高。這可能與菌體對營養物質的利用和代謝產物的積累有關。適宜的發酵時間為4～5 h。

2.1.5發酵溫度對發酵綠豆漿感官品質的影響

發酵溫度對發酵綠豆漿感官品質的影響見表6。由表6可知，隨著溫度的升高，綠豆漿的組織狀態評分逐漸升高，而色澤、氣味和綜合評分均先升高后降低。在發酵溫度為30℃時，色澤、氣味和綜合評分均達到最大值。適宜的發酵溫度約為30℃。

表6 發酵溫度對發酵綠豆漿感官品質的影響

2.2 正交試驗結果

以復合菌種比、接種量、加糖量、發酵時間和發酵溫度為因素設計正交試驗L16(45)，以發酵綠豆漿的pH值、酸度、GABA含量、植酸含量、感官綜合評分為指標確定最佳發酵條件，試驗結果見表7。對試驗結果進行方差分析，結果見8。

表7 正交試驗設計及結果

由表8可知，影響發酵綠豆漿pH值和酸度的因素按主次順序為：B>A>C>D>E，且各因素影響水平均為極顯著(P<0.01)；影響發酵綠豆漿GABA含量的因素按主次順序為：D>B>E>A>C，且B、D的影響水平為極顯著(P<0.01)，A、C、E的影響水平為顯著(P<0.05)；影響發酵綠豆漿的植酸含量因素按主次順序為：E>D>B>A>C，且A、B、D、E的影響水平為極顯著(P<0.01)，C因素不具有顯著性(P>0.1)；影響發酵綠豆漿感官綜合評分的因素按主次順序為：A>B>D>E>C，且A、B、D的影響水平為極顯著(P<0.01)，E的影響水平為顯著(P<0.05)，C的影響水平不顯著(P>0.1)。

表8 正交試驗方差分析表(F/P)

正交試驗均值分析表見表9。

由表9可知，以GABA含量為評價指標，最佳發酵條件為A2(A3，A4)B3(B4)C3D3(D4)E1(E2)，即復合菌種比為1∶1(2∶3，1∶2)，接種量為1.0%(1.4%)，加糖量5%，發酵時間為5 h(6 h)，發酵溫度為20℃(25℃)。以植酸為評價指標，最佳發酵條件為A3B2C3D1E2，即復合菌種比為2∶3，接種量為0.6%，加糖量5%，發酵時間為3 h，發酵溫度為30℃。以感官綜合評分為評價指標，最佳發酵條件為A3B3C4D3(D4)E3(E4)，即復合菌種比為2∶3，接種量為1.0%，加糖量7%，發酵時間為5 h(6 h)，發酵溫度為35℃(40℃)。綜合各因素的重要性，最優發酵條件為A3B3C3D3E2，即復合菌種比為2∶3，接種量為1.00%，加糖量為5%，發酵時間為5 h，發酵溫度為30℃。

表9 正交試驗均值分析表

2.3 驗證試驗結果

驗證試驗結果見表10。

由表10可知，工藝1的pH值和植酸含量均明顯高于工藝2和工藝3，酸度、GABA和綜合評分均低于工藝2和工藝3，說明發酵條件對綠豆漿的pH值、酸度、GABA含量、植酸含量和綜合評分均有顯著作用。工藝2的GABA含量和感官綜合評分明顯高于工藝3，工藝3的植酸含量與工藝2無顯著性，由此確定最佳發酵條件為工藝2，即復合菌種比為2∶3，接種量為1.0%，加糖量為5%，發酵時間為5 h，發酵溫度為30℃，此時γ-氨基丁酸含量可達129.53±1.70 mg/(100 g)，植酸含量減少至1.29±0.13 mg/g。與未發酵的樣品相比，γ-氨基丁酸含量增加了39.6%，植酸含量減少了54.1%。

表10 驗證試驗結果

3 結論

本試驗利用卡斯特酒香酵母ZSM-001和植物乳酸桿菌ZSM-002進行復配，在研究復合菌比例、接種量、糖添加量、發酵時間和發酵溫度對發酵綠豆漿的感官品質影響的基礎上，進行了發酵工藝條件優化研究，確定了適宜的發酵工藝條件為乳酸菌與酵母菌復合菌種比2∶3，接種量1.0%，加糖量5%時，于30℃下發酵5 h。采用該工藝所得產品中γ-氨基丁酸含量可達129.53 mg/(100 g)，植酸含量減少至1.29 mg/g。