基于多酚類和嘌呤類代謝表型的沿河古茶樹紅茶適制性評估

方仕茂，戴宇樵，楊 婷，田小強，田洪軍，劉忠英，潘 科*

1.貴州省農業科學院 茶葉研究所，貴州 貴陽 550006；

2. 沿河土家族自治縣生態茶發展和技術指導中心，貴州 沿河 565300

沿河縣擁有豐富的古茶樹資源。2016年，中國茶葉流通協會授予沿河縣“中國古茶樹之鄉”稱號，全縣茶葉面積達1.33萬hm2[1]。根據已有古茶樹資源調查結果，該縣下轄思渠、黃土、新景、客田、塘壩、后坪和洪渡等8個鄉（鎮）35個村共有古茶樹4萬余株[2]。該地區古茶樹類型主要分為喬木型和灌木型[3]。不同樹型古茶樹鮮葉內含成分具有一定差異[4-5]。目前沿河縣茶企利用古茶樹資源開發古樹紅茶、古樹綠茶和古樹白茶等產品，對部分古茶樹鮮葉加工技術進行了探究[6-8]，但對縣域內不同區域古茶樹鮮葉內含成分及區域內產品差異缺乏分析。

茶鮮葉中的多酚類與嘌呤類物質是評估其適制性的重要物質，同時也是影響茶葉色香味品質形成的關鍵物質[9-10]，多酚含量等指標通常用于品種的選育[4]。古茶樹由于其樹齡及管護條件不同（如修剪等）呈現一定代謝差異[11]，且在基因表達方面亦有不同[12]。此外，不同季節茶樹新梢積累的多酚和嘌呤堿影響著茶葉的適制性；一般而言，夏茶或秋茶較春茶含有更高的酯型兒茶素和咖啡堿，制成相同的茶類其茶湯苦澀味更重。將夏秋茶鮮葉用于加工發酵類型茶類（如紅茶、黑茶或白茶等），可避免苦澀味重影響茶葉價值。古茶樹資源稀缺，古樹春茶產量有限，為提高資源利用程度，增加古茶樹產品的經濟效益，對秋季灌木型古茶樹鮮葉加工紅茶品質進行評估十分必要。

本研究利用HPLC技術結合化學計量學分析不同樹型（喬木型和灌木型）、區域及季節的古茶樹茶鮮葉和干茶中多酚類、嘌呤類等物質含量差異，以評估古茶樹鮮葉的紅茶適制性，可為沿河縣古茶樹資源的合理開發利用提供解決方案。

1 材料與方法

1.1 茶樣收集

2020年4月1 ～ 17日于后坪鄉和客田鎮收集喬木型一芽二葉鮮葉，于塘壩鎮和新景鎮收集灌木型一芽二葉鮮葉。每次從收集茶青中代表性扦取450 g，并均分3份，用鋁箔紙裝裹，浸入液氮5 min，隨后轉入干冰，保存于-80℃冰箱，直至真空冷凍干燥45 h。干茶為收集的部分古茶樹鮮葉經萎凋、揉捻、發酵和干燥加工而成，生物學取樣3份，每份約250 g。同年9月20 ～ 23日收集沿河縣塘壩鎮秋季紅茶樣，加工和取樣方法與春茶取樣一致。所有樣品均經研磨，過40目篩。

1.2 主要儀器與試劑

LC2030C Plus 高效液相色譜儀（日本Shimadzu公 司）， 配 備XBridge BEH C18 Column, 130?, 5μm, 4.6 mm×250 mm, 1/pkg 色譜柱（美國Waters公司）。乙腈和甲醇均為色譜級（美國Tedia公司）。沒食子酸（GA）、表沒食子兒茶素（EGC）、(+) -兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、咖啡堿（CAF）、綠原酸（CA）和可可堿（TB）標準品（美國Cato Research Chemicals Inc.）。茶黃素（TF1）、茶黃素-3-單沒食子酸酯（TF-3-G）、茶黃素-3'-單沒食子酸酯（TF-3'-G）和茶黃素-3,3'-雙沒食子酸酯（TFDG）（上海源葉生物技術公司）。乙腈、甲醇和乙酸（色譜級，美國Tedia公司）。

1.3 HPLC分析

兒茶素類、酚酸類和嘌呤堿類化合物提取、檢測基于GB/T 8313—2018方法執行。茶黃素類化合物提取檢測基于GB/T 30483—2013方法執行。繪制濃度（x軸）與同一保留時間的峰值面積（y軸）的關系，構建每一單標的標準曲線圖。總兒茶素（TCs）含量等于各兒茶素即C、GC、EGCG、GCG、EC、EGC、ECG含量之和。茶黃素類（TFs）含量等于TF1、TF-3-G、TF-3'-G和TFDG含量之和。

1.4 感官審評

參照GB/T 23776—2009進行。審評人員5人，其中3女2男，均為貴州省農業科學院茶葉研究所研究人員，且均具有高級審評員資格。

1.5 數據處理

色譜數據均基于LabSolutions工作站獲取，進一步的分析和圖表可視化通過Excel、IBM SPSS Statistics和Origin 2017 64Bit軟件實現。

2 結果分析

2.1 不同樹型古茶樹茶鮮葉內含成分差異

如圖1，喬木型古茶樹鮮葉中咖啡堿（41.04±3.62）和可可堿（4.31±0.47）含量均分別顯著高于灌木型的38.44±2.63 mg/g和3.22±0.97 mg/g。綠原酸和沒食子酸是茶葉中兩個典型的酚酸化合物，其含量在喬木和灌木鮮葉中的含量無顯著差異，值得注意的是在喬木鮮葉中綠原酸的組內含量差異較大（2.73±0.79 mg/g）。

兒茶素是茶葉中含量最豐富的物質[13]，根據其化學結構和貢獻的滋味特征不同，分酯型兒茶素和非酯型兒茶素[14]。檢測結果表明：喬木型古茶樹鮮葉中兒茶素總量為210.32±15.42 mg/g，灌木型為213.29±19.66 mg/g，p = 0.612。其中，喬木型古茶樹鮮葉中酯型和非酯型兒茶素分別為 169.49±9.88 mg/g和 40.82±6.21 mg/g， 而在灌木型古茶樹鮮葉中則分別為165.60±11.61 mg/g和47.69±8.88 mg/g。對比分析EGCG、ECG和GCG三個酯型兒茶素含量（圖1），灌木型古茶樹鮮葉中EGCG含量（128.71±9.33 mg/g）與ECG含量（34.61±4.60 mg/g）分別顯著高于喬木型古茶樹鮮葉（119.44±9.12 mg/g、25.71±4.26 mg/g），而GCG在喬木型古茶樹鮮葉中的含量（24.34±4.26 mg/g）則顯著高于灌木型古茶樹鮮葉（2.28±1.09 mg/g）。灌木型古茶樹鮮葉中非酯型兒茶素EGC與EC顯著高于喬木，C含量則相反，GC在兩種樹型鮮葉中差異明顯。

圖1 喬木型和灌木型茶樹鮮葉多酚和嘌呤類物質的含量差異（獨立樣本T檢驗，雙尾）Figure 1 Differences in the content of polyphenols and purines in fresh leaves of arbor type and shrub type tea trees （Independent samples t-test, two-tailed）

2.2 不同區域古樹紅茶內含成分差異及品質特征

對收集的新景鎮、客田鎮、后坪鄉和塘壩鎮的古樹紅茶樣中酚類和嘌呤類含量結合主成分方法進行產地區分。如圖2D可知，基于19個化合物×69個樣品數據矩陣的主成分分析，共提取特征值大于1的有效主成分3個，其特征值分別為9.978、3.379和2.247（圖2D-b）。前三個主成分累計解釋方差大于82%，其中第一主成分PC1解釋方差為52.515%，第二主成分PC2=17.785%，第三主成分PC3=11.825%（圖2D-a）。由載荷圖2A、圖2B可知，PC1主要由茶黃素（正相關）和酯型兒茶素（負相關）貢獻，PC2則由非酯型兒茶素貢獻（圖2A中的圓點即陰影部分），PC3對于區域樣品的區分不明顯（圖2A、圖2B中的三角形）。由圖2C可知，沿河縣不同鄉鎮由于古茶樹鮮葉加工的紅茶內含成分存在差異，且后坪鄉和塘壩鎮紅茶樣得到明顯的區分。新景鎮的茶樣與塘壩鎮樣品接近，客田鎮的樣品則與后坪鄉的樣品聚類明顯。

圖2 主成分分析Figure 2 Principal component analysis

根據我們收集的樣品類型可以推測后坪鄉和客田鎮的古茶樹鮮葉為大葉種或形態學接近喬木，而新景鎮和塘壩鎮以灌木型為主，因此在鮮葉內含成分上有一定差異（圖1）。其次，不同區域的加工工藝差異，或進一步促進不同區域古樹紅茶樣的內含成分差異[15]，使得后坪鄉和塘壩鎮的古樹紅茶樣品在PC1上得到很好的區分，即后坪鄉的紅茶樣相較于塘壩鎮的紅茶樣含有更高的茶黃素類物質和含量較少的酯型兒茶素。

2.3 不同季節古茶樹鮮葉紅茶適制性

咖啡堿是賦予茶湯苦澀味和收斂性的重要物質[15]。由表2可知，咖啡堿含量在春、秋兩季的古樹紅茶中無差異（p＞0.05），但顯著高于當季的福鼎大白茶品種制成的紅茶。已有研究表明，采用栽培型茶樹品種的春（36.558 ±5.024 mg/g）、夏（38.721 ± 6.059）茶鮮葉制成的綠茶的咖啡堿無顯著差異[16]，這可能是由于古茶樹與栽培種茶樹代謝差異導致的[19]，因此可推測灌木型古茶樹積累咖啡堿受不同季節影響較小，且咖啡堿積累代謝較栽培種茶樹強。

表2 春季和秋季古樹紅茶內含成分差異（干重 mg/g）Table 2 Differences in the contents of ancient tree black tea in spring and autumn（dry weight mg/g）

春季古茶樹紅茶中非酯型兒茶素、酯型兒茶素、兒茶素總量和茶黃素總量顯著高于同季福鼎大白茶和秋季茶樣，進一步的對比分析古茶樹秋茶的非酯型兒茶素和茶黃素總量與春茶沒有顯著差異，由于茶黃素對于紅茶茶湯的色澤和豐富度貢獻較大[17]，秋茶在茶湯湯色豐富度方面與春茶接近（表3）。此外，古茶樹秋茶酯型兒茶素（16.72±0.16 mg/g）顯著低于古茶樹春茶（44.20±10.74 mg/g），這與已有的夏秋季鮮葉酯型兒茶素積累較春茶多的研究報道不一致[15,18]。感官審評結果表明，夏秋古茶樹鮮葉加工的紅茶滋味特征與春茶均表現為甜醇等特點，無明顯的苦澀味。值得注意的是，古茶樹春茶中由于取樣數量較多（7次加工收集樣品），組內差異較大，導致數據的標準偏差較大，從而使得部分組間比較結果差異不明顯或明顯。總而言之，試驗結果表明，夏秋古茶樹鮮葉具有潛在的利用價值，但仍需進一步評估春、秋季紅茶鮮味物質和香氣特征。

表3 春、秋季節灌木型古樹紅茶感官審評Table 3 Sensory evaluation results of shrub type ancient tree black tea in spring and autumn

3 結論和討論

沿河縣古茶樹資源豐富，資源利用潛力大。但由于該縣域內古茶樹分布廣，各區域品質差異較大。此外，由于樹型差異，茶鮮葉質量不均勻，限制了資源的開發利用。本研究明確了喬木型和灌木型古茶樹鮮葉中的多酚類和嘌呤堿類物質的代謝差異特點，并以灌木型古茶樹鮮葉加工紅茶探究不同區域紅茶的品質特征，對比分析了不同季節加工成的紅茶品質差異。

大尺度區域條件下古茶樹資源的品質成分分析已得到報道[5,19]，同時從基因水平分析古茶樹的代謝特點[12]。由于古茶樹的樹齡及環境影響，使得其代謝特征與栽培中有所差異[20]。此外，古茶樹在不同季節的代謝物變化與栽培種亦有差異，研究表明栽培種在春、夏、秋三季的苦澀類物質增加，而鮮味物質減少[17]。本研究結果表明，古茶樹鮮葉酯型兒茶素和咖啡堿等物質隨著季節變化不顯著。加工是影響古茶樹品質的另一重要因素，通過合適的加工方式可以重塑茶葉產品品質，因而可以規避不同茶鮮葉品質、區域以及季節影響，實現品質保障。對古茶樹資源的適制性評估，僅從多酚及嘌呤類含量評估是不完備的，還需評估古茶樹中游離氨基酸、糖類及揮發性物質等在不同樹型、區域和季節的差異，同時還需系統評估加工因素對其品質的影響。