固相萃取-高效液相色譜法測定奶糖中7種合成著色劑的含量

張楠楠 上海工微所科技有限公司，上海 200233

食品著色劑是為食品著色的一類食品添加劑，分為天然著色劑和合成著色劑。合成著色劑由于色澤鮮艷，易著色，成本較低，穩定性好，在食品加工過程中被廣泛使用。然而長期過量攝入到人體，可能會導致慢性中毒，更有甚致畸致癌等風險[1]。因此，我國GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》[2]中對不同食品中各種合成著色劑的使用和限量做出了明確規定。

目前測定合成著色劑的方法也比較多，如高效液相色譜法[3,4]、超高效液相色譜法[5]、液相色譜-串聯質譜法[6]等，高效液相色譜法是較為普遍的檢測手段，且對實驗室設備要求相對較低。GB 5009.35—2016[7]和SN/T 1743—2006[8]中高效液相色譜法測定食品中合成著色劑的方法，是采用聚酰胺粉吸附法進行提取，但在實際操作過程中，由于過程繁瑣，損耗嚴重，影響實驗結果的準確性和檢測效率[9]。固相萃取法是目前常用的一種提取方法，能夠對樣品中的色素進行凈化和富集，并能最大程度的降低雜質對結果的影響，具有方便快速、重復性好等優點被廣泛應用[10]。

本文通過沉淀劑沉淀奶糖樣品中的蛋白質、脂肪和明膠等物質，甲醇∶水∶10%氨水溶液(7∶2∶1，v/v)溶液提取，混合弱陰離子交換小柱凈化，高效液相色譜法多波長檢測奶糖中的檸檬黃、日落黃、新紅、胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅和亮藍這7種合成著色劑的含量，靈敏度高，準確，簡單，實用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：奶糖，市售。

7種合成著色劑：檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍和誘惑紅標準品(1 000 μg/mL，北京海岸鴻蒙標準物質技術有限責任公司)；氨水、甲酸、硫酸鋅、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，DIKMA)；乙酸銨(色譜純，MACKLIN)，實驗室用水均為一級水。

1.2 儀器與設備

Thermo Scientific U3000高效液相色譜儀(DAD-3000二極管陣列檢測器，賽默飛世爾科技公司)；超聲波清洗器(KQ-100，昆山市超聲儀器有限公司)；固相萃取儀(Supelco SPE)；CNW poly-sery PWAX弱陰離子交換SPE小柱(150 mg/6 mL，北京迪馬科技公司)；防腐氮吹儀(EFTT-DC12，上海安譜實驗科技股份有限公司)；電子天平(MS204TS，梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；離心機(TDL-5A，上海安亭科學儀器廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1標準曲線的配制

準確吸取200 μL檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍和誘惑紅標準品于10 mL容量瓶中，加水溶解配制成20.0 μg/mL的儲備液，再逐級稀釋至0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL、2.00 μg/mL和5.00 μg/mL。

1.3.2儀器條件

色譜柱：SunShell C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；

保護柱：SunShell Guard Cartridge Column RP；

流動相：A:甲醇；B：0.02 mol/L乙酸銨；

流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：10.0 μL；

檢測器：二極管陣列檢測器；

檢測波長：400 nm，529 nm，630 nm。

梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.3.3樣品前處理

稱取2 g(精確至0.000 1 g)樣品于離心管中，加5 mL溫水溶解，5 mL硫酸鋅溶液(120 g/L)，10 mL甲醇∶水∶10%氨水溶液(7∶2∶1，v/v)溶液，用氨水調節pH至8.0～9.0，震蕩均勻，超聲30 min，4 500 r/min離心5 min，收集上清液，重復提取3次，合并上清液。用甲酸調節上述溶液pH至6.0，待凈化。PWAX弱陰離子交換小柱使用前先用5 mL甲醇和5 mL水活化小柱，取10.0 mL待凈化液上樣，用5 mL水淋洗小柱并吹干，最后用5 mL10%的氨化甲醇洗脫，收集洗脫液。洗脫液于50 ℃水浴并氮吹至近干，用甲醇∶0.02 mol/L乙酸銨溶液(1∶1，v/v)定容至1.0 mL，混勻，經0.45 μm水相濾膜過濾上機。

2 結果與討論

2.1 HPLC檢測色譜圖

國家標準GB 5009.35—2016[7]和SN/T 1743—2006[8]選擇254 nm作為檢測波長，由于該波長是折中選取了各色素都有吸收的一個共用波長，既不是各色素的最大吸收波長，又不是干擾少、穩定性好的最佳檢測波長[11,12]，因此在此波長下可能會導致某些色素化學吸收有干擾，靈敏度較低。為了使7種合成著色劑均有較好的靈敏度，本文采用二級陣列檢測器全波長(200 nm～900 nm)對7種合成著色劑進行全波長掃描，根據各合成著色劑的吸收光譜圖確定檸檬黃和日落黃的最佳檢測波長為400 nm，莧菜紅、胭脂紅、新紅和誘惑紅的檢測波長為529 nm，亮藍的檢測波長為630 nm。由圖1可知，在相應的檢測波長下，7種合成著色劑的背景干擾小，響應值高。

A：400 nm；B：529 nm；C：630 nm圖1 合成著色劑標準品色譜圖

2.2 前處理優化

2.2.1沉淀劑的選擇

奶糖中主要的干擾物質有蛋白質、脂肪和明膠等，如果不除去這些干擾物，則試樣液較渾濁，不利于固相萃取柱的凈化。通過試驗分別采用硫酸-鎢酸鈉溶液、乙酸鋅-亞鐵氰化鉀溶液、三氯乙酸-乙腈溶液、硫酸鋅-氫氧化鈉溶液、硫酸鋅-氨水溶液這幾個沉淀體系沉淀蛋白。實驗結果表明，硫酸-鎢酸鈉溶液和三氯乙酸-乙腈溶液無法有效沉淀，離心后上清液仍然混濁，無法進行下一步固相萃取凈化。由于部分色素在較酸或較堿條件下，顏色易發生變化，因此在硫酸鋅溶液作用下沉淀，氫氧化鈉溶液調節樣液pH，會影響提取效果。乙酸鋅-亞鐵氰化鉀和硫酸鋅-氨水溶液作為沉淀劑對7種合成著色劑的提取效果的影響見表2。由表2可知，乙酸鋅-亞鐵氰化鉀沉淀體系的回收率偏低，可能是由于部分合成著色劑與蛋白共同被沉淀分離，致回收率偏低，并且乙酸鋅-亞鐵氰化鉀自身的顏色使被測溶液顏色發生變化產生干擾，達不到檢測目的。硫酸鋅-氨水溶液能有效的沉淀蛋白質和脂肪，得到較好的回收率，因此本文選擇該沉淀體系。

表2 不同沉淀劑對合成著色劑回收率(%)的影響

2.2.2提取液的選擇

將奶糖加水溶解后，加5 mL硫酸鋅溶液沉淀，氨水調節pH后，加入不同的提取液進行合成著色劑的測定。經查閱文獻[13-17]，本文選擇用水∶10%氨水溶液(9∶1)、甲醇∶水∶10%氨水溶液(7∶2∶1)、乙醇∶水∶10%氨水溶液(7∶2∶1)、甲醇∶乙腈∶水∶10%氨水溶液(5∶3∶1∶1)、乙醇∶乙腈∶水∶10%氨水溶液(5∶3∶1∶1)、甲醇∶乙醇∶乙腈∶10%氨水溶液(3∶3∶3∶1)這六種不同的提取液進行比較，以上比例都為體積比，結果見表3。

由表3可知，通過比較上述六種提取液提取效果，發現甲醇∶水∶10%氨水溶液(7∶2∶1，v/v)的提取效果最好，既能保證色素的萃取效果，又能降低蛋白質等干擾物在提取液中的溶解程度，更有利于固相萃取的凈化。此外，使用提取液萃取樣品中的色素時，提取次數越多，會導致上清液越渾濁，越不利于固相萃取。因此，甲醇∶水∶10%氨水溶液(7∶2∶1，v/v)提取液重復提取三次，即能把奶糖中的合成著色劑提取完全，也能保證提取液較快較好的凈化。

表3 不同提取液對合成著色劑回收率(%)的影響

2.3 線性范圍和檢出限

由表4可知，在0.02 μg/mL～20.00 μg/mL的線性范圍內，7種合成著色劑具有較好的線性關系，線性相關系數r≥0.999 96。以3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限，7種合成著色劑的檢出限見表4。

表4 7種合成著色劑保留時間、線性方程、 相關系數及檢出限

2.4 加標回收率

選擇原味奶糖樣品進行加標回收率實驗，分別添加3個水平混合標準溶液，每個水平做6個平行，采用硫酸鋅-氨水溶液沉淀，甲醇∶水∶10%氨水溶液(7∶2∶1，v/v)溶液提取，PWAX小柱凈化，上機測定，計算得出加標回收率和相對標準偏差如表5所示。加標濃度為0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg時，該方法7種合成著色劑的回收率為82.9%～99.2%，相對標準偏差為0.36%～2.78%，能滿足檢測要求。

表5 奶糖中7種合成著色劑的平均回收率和 相對標準偏差(n=6)

2.5 樣品檢測情況

在市場上購買不同口味的奶糖，采用1.3.3實驗方法，檢測其樣品中的合成著色劑含量，結果如表6所示。結果表明，在這些樣品中，不同口味的奶糖中均檢出合成著色劑，但均未超出標準GB 2760—2014[2]中規定的最大使用限量。

表6 不同口味奶糖合成著色劑檢測情況

3 結論

本試驗建立了一種簡便、高效的，可同時測定奶糖中7種合成著色劑含量的方法。通過比較不同沉淀劑的沉淀效果，以及不同提取液對樣品中合成著色劑的提取效果，選擇硫酸鋅-氨水溶液沉淀蛋白，甲醇∶水∶10%氨水溶液(7∶2∶1，v/v)溶液提取，采用弱陰離子交換固相萃取小柱對樣品中的合成著色劑進行凈化富集，7種合成著色劑實現了良好的分離。同時利用二極管陣列檢測器多波長分析功能，提高目標物的響應值，降低了樣品中基質的干擾，從而獲得更低的檢出限和更好的精密度。7種合成著色劑在0.02 μg/mL～20.00 μg/mL的濃度范圍內線性良好，相關系數r均大于0.999 96，方法檢出限為0.03 mg/kg。加標水平在0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg時，平均回收率在82.9%～99.2%之間，相對標準偏差小于2.8%，并且能滿足實際樣品分析的需要。該方法簡便、快速、準確，適合于奶糖樣品中多種合成著色劑的同時測定。針對其他基質較為復雜的樣品，也可參考該方法開展檢測。