液體曲制酒精研究的回顧

胡學智 上海市工業微生物研究所， 上海 200233

酒精是重要的有機化工原料，也是一種重要的燃料。液體曲制酒精是酒精工業的重大革新，也是新中國成立后我國發酵工業的一項重大科研項目，它的研究成功，首次把抗生素生產的深層培養技術引進到我國的發酵行業，為酒精發酵生產的機械化自動化打下了基礎，也為我國的氨基酸、檸檬酸、酶制劑等新型發酵產業的建立奠定了基礎。作者有幸親歷該項目的研究，深感有責任將該研究的來龍去脈作一記敘，為我國發酵工業提供點滴史實。

1956年春，我由上海衛生食料廠(即后來的上海酵母廠)調到市食品工業公司技術科工作，分管發酵行業。當時上海的發酵行業規模很小，只有上海酒精廠、華星酒精廠、華光啤酒廠、上海啤酒廠和上海酵母廠五家，而眾多的醬油廠與酒廠，除了益民釀造廠外，都不屬于市食品工業公司所管。當時我的工作是收集和審核各廠的生產日報表以及組織行業協作組各種生產活動。

某日，科長梁石民同志取出一份材料要我閱辦和提出意見，這是時任市第一輕工業局試驗室、上海酒精廠、華星酒精廠、屈臣氏汽水廠四家單位的顧問陳騊聲先生寫的一份關于開展液體曲制酒精研究的立題申請報告。關于液體曲我略知一二，也頗感興趣。所謂液體曲在美國稱為“深層培養糖化酶”(submerged culture of glucoamylase)，在日本叫作“液曲”即“液體曲”(Liquid koji)，是采用生產抗生素同樣的方法，在發酵罐中通氣攪拌培養而成的富含淀粉酶的霉菌培養物。以往在以甘薯、玉米和木薯等淀粉原料發酵生產酒精時，經蒸煮過的料醪必須先用曲子(麩曲)或麥芽(二者均含淀粉酶)將淀粉的一部份轉化成還原糖后，才可用酵母發酵成酒精，麩曲的質量直接影響到酒精的收率。制曲是一個勞動強度非常大的工藝過程。以日產酒精7噸的某廠為例來說，每天需投入2000多kg麩皮，用20多名強壯工人來制曲，使用5000多個木盤來盛曲培養，培養麩曲的曲室占地300 m2～500 m2，既悶熱又潮濕，像個碩大的蒸籠，工人在內勞動操作條件惡劣且甚易感冒，亟需改進。若使用液體曲來代替麩曲，則生產可以機械化、自動化，人力成本與勞動強度可大大降低，此項技術1948年首先由UNDERKOFLER博士發明并用于酒精生產，日本也在上世紀50年代初在富金源孝教授領導下研究完成并用于生產。為此我就去局試驗室和酒精廠進一步了解和調查研究，深感此項研究意義之重大和必要性，乃積極爭取局領導的支持，終獲批準立項，并呈報食品工業部。是年食品工業部召開的全國食品科研計劃會議將液體曲研究列為全國重點項目之一，由市一輕局試驗室為負責單位，中科院微生物研究所、食品工業部上海科學研究所(即現輕工業部食品發酵研究院)、食品工業部制酒局、華南工學院共同成立試點委員會開展工作。我也因此調入市第一輕工局試驗室工作。雖有多家單位參加液體曲試點委員會，但食品工業部上海科學研究所只派了一位同志來市一輕局實驗室參加試驗，華南工學院則由余蔚英教授另行組織團隊自行研究,其他單位只是掛名而已。

去試驗室報到時，液體曲研究才開始，參加研究工作的是兩位學化工合成的同志，因不熟悉發酵業務，工作開展比較困難，只有我是發酵專業的畢業生(1953年下學期曾在有“中國抗生素工業搖籃”之稱的上海第三制藥廠畢業實習了半年多，在童村廠長、蔡聿彪總工、許文思和余爾谷等專家的指導下學習，故對抗生素發酵有關技術比較熟悉)，于是仿照第三制藥廠的一套辦法，置備起搖床、滅菌室等設備，碰到困難則請教第三制藥廠的專家，工作終于逐步開展起來。

不久食品工業部上海科學研究所派了張餳清同志來參加工作(她是南京工學院1957年發酵專業畢業生，是我的師妹)，梁天錫(是我復旦大學農業化學系農產品加工組1953年畢業的師兄)、張家銳(解放前在前實業部工業試驗所工作，與陳騊聲先生曾共事)都先后到來。梁、張與我三人在陳先生領導下分三個組分頭負責菌種、培養基篩選與車間中間試驗。試驗室還辦起了技術培訓班，從社會上吸收一批高中畢業生來學習以充實試驗室各課題組的人員，人員增加了，科研進度也大大提高。其時日本農藝化學代表團來華學術交流，在北京作了糖化酶與液體曲的研制等精彩的報告，來上海時又專程來我室訪問和座談，使我們獲益不少。上世紀50年代國人對淀粉酶的認識還非常模糊，以為曲霉的淀粉酶即是麥芽所含的β-淀粉酶，曲霉糖化力用生成的麥芽糖量來表示，直到1957年8月日本農藝化學代表團富金源孝、飯塚廣教授來華作學術交流，作了“糖化發酵的酶化學研究”、“用液體曲制造酒精的概要”等學術報告，加上中國科學院微生物研究所張樹政教授發表了“霉菌的淀粉酶”的綜述論文，對國外有關霉菌淀粉酶的研究作了詳細的介紹，才使大家對霉菌淀粉酶有了一個較全面的認識，這些知識對我們的研究工作有著莫大啟發和指導意義。

我們對由國內收集的曲霉和中科院上海植物生理研究所焦瑞身先生贈送的黑曲霉NRRL 330與黑曲霉NRRL 337開展了試驗，對酒精廠先前使用的產黃綠色孢子的米曲霉NO.7同黑曲霉NRRL 330等經酸、熱處理作了對比，建立了適合于菌種與培養基篩選大量樣品測定的方法。在上海酒精廠合作下，通過90多批200 L發酵罐的擴大試驗，發現供試的6株曲霉(甘薯曲霉,黑曲霉NO.2,黑曲霉NRRL 330,黑曲霉NRRL 337,米曲霉NO.7)中以黑曲霉NRRL 330、黑曲霉NO.2為最佳，向蒸煮醪添加10%～15%的液體曲便可完全代替6%的麩曲來生產酒精(據報道國外液體曲用量在10%～20%)，美國生產液體曲的菌種是黑曲酶NRRL 337，日本使用的菌種是泡盛曲霉，這說明了當時我國的液體曲研究起點并不低。

1957年底在上海酒精廠對NRRL 330用2 000 L培養基作了液體曲擴大培養試驗(結合實驗室用三角瓶進行酒精發酵試驗)，也表明使用10%液體曲大型發酵罐培養的液體曲糖化，其酒精發酵的淀粉利用率與使用麩曲糖化者相當，均在90%左右。以上試驗也表明了我國酒精廠使用的糖化用菌種并不乏優良菌株。

由于當時我國對科研成果還未建立成果鑒定與驗收制度，一些科研信息大多是通過行業內交流或從刊物報導上獲取而被采用的。60年代以后，隨著市場的需要，不少研究和生產單位對糖化酶生產菌積極進行人工誘變，先后獲得了一批糖化酶活力較高的菌種，如滬輕2號、東酒1號、M 85、UV-06、NCN 24等等，每毫升液體曲糖化淀粉轉化成葡萄糖的能力由M 85的3 g逐漸提高到3917-2的10 g、黑曲霉165的20 g。液體曲的研究也演變成糖化酶的研究，其測定酶活力的內容就只偏重于糖化力一項了。

1980年以后，國家實行了改革開放，國際學術交流也日趨頻繁。以中國科學院微生物研究所獲得黑曲霉突變株UV-11為契機，使糖化酶活力轉化淀粉成葡萄糖的能力一舉提高到70 g，每毫升發酵液的酶活力達6 000單位以上。隨著研究的進一步深入，上世紀末糖化酶活力已達10 000單位以上，與當年液體曲NRRL330只有數百單位比較已不可同日而語。可以這樣說，我國液體曲的研究為以后糖化酶研究的開展創造了有利條件。根據回憶,當年在液體曲項目研究中可總結出以下幾點：改進了糖化酶活力的測定方法，使之適合于菌種篩選、培養基篩選等大量樣品的酶活力測定；對國內所用糖化酶生產菌的酶活力進行了篩查，得知國內釀酒廠和酒精廠所使用的菌種中也不乏糖化酶活力高的菌株；通過實踐對黑曲霉NRRL 330，米曲霉NO.7的淀粉酶酶系和酒精發酵的關系有了進一步的了解；以及培養基和培養條件對黑曲霉NRRL 330產淀粉酶及酒精產率的影響等，有助于酶的利用。

1 改進了糖化酶活力的測定方法

在中國科學院微生物研究所以及國內釀酒廠和酒精廠的支持下收集到了一批菌種，包括上述中科院上海植物生理研究所焦瑞身先生慷慨贈送給我們研究的糖化酶生產菌黑曲霉NRRL 330與NRRL 337。當時國內酒精廠和釀酒廠還沒有建立起一個評估酒曲優劣的方法，或僅憑經驗來判斷，少數酒精廠則使用了國外應用多年的Lintener林奈法來測定酶活力，操作繁瑣、準確度差，不適于需大量樣品測定的篩選菌種或培養基的工作。而文獻發表的其他一些方法，大多是在三角瓶中添加底物和淀粉酶，同樣都很麻煩而不適于大量樣品糖化酶活力的測定。針對三角瓶體積大、在水浴中測定樣品數量有限且容易側翻的缺點，筆者將底物與酶的反應改為置于大號試管中進行，一個試管架可容納40支試管，對20個樣品可同時反應，而生成的還原糖則改用Willstater的碘法測定，避免了銅試劑之需置于火上加熱的操作。為了檢驗碘量法的可靠性，筆者曾對山芋、玉米、麩皮、米糠等原料分別用酸水解法或先用淀粉酶抽提其中淀粉，再用酸水解將其轉化成還原糖后，分別用Lane-Eynon法、標準葡萄糖液反滴定法、Bertrand法以及碘定量法進行了比較(見表1)。結果表明,碘量法適用于山芋、玉米、大米等纖維素含量和雜質含量低的原料的直接酸水解物中還原糖量之測定，而不適用于麩皮米糠等雜質多的樣品水解液中還原糖量之測定，即使先用α-淀粉酶抽提其淀粉成為糊精，再酸水解的樣品中還原糖之測定，結果也會偏高而不適用，但對于酶活測定時所用底物是純淀粉，液體曲培養基中即使有少量粗原料殘余，對碘量法也不致造成明顯的影響，且因碘量法中使用淀粉溶液作指示劑，滴定終點明析，精確性高，酒精發酵得率與酶活力基本一致(見表2)。我們以pH 4.6、40 ℃反應1 h，生成1 mg麥芽糖(當時認為糖化酶水解淀粉生成的還原糖是麥芽糖)為一個酶單位。這一小小改進卻成為日后糖化酶研究的有力工具。

表1 用不同方法測定淀粉原料水解物還原糖

表2 液體曲淀粉酶系中幾種酶對酒精發酵的影響

此法在上海酒精廠使用后，林奈法逐步被淘汰。通過行業交流,碘量法被酒精行業廣泛采用，也被編入了輕工業部高等教材《工業發酵分析》一書(輕工出版社,1979)。80年代以后，一些合資企業、外資企業其糖化酶產品活力紛紛采用各自制定的方法測定，以致產品之間無從比較。但筆者認為我們采用的方法還是比較可靠，方便實用。此法經發酵協會驗證并稍作改進后呈報國家標準局,被列為糖化酶國定測定方法。

2 糖化酶生產菌酶活力的篩選及黑曲霉NRRL 330與米曲霉NO.7淀粉酶系性質之比較

我們對收集的若干黑曲霉及其他曲霉中的8株進行了糖化與酒精發酵試驗，結果表明以NRRL 330的糖化酶活力為最強，但在我國酒精廠中所使用的菌種中如甘薯曲霉、黑曲霉NO.2等其糖化酶活力并不遜于NRRL 330。試驗表明,影響酒精發酵得率的酶主要是糖化酶和麥芽糖酶，而α-淀粉酶活力的大小與酒精得率無直接關聯(表2)。

為了了解酸、熱對麥芽淀粉酶的影響，1953年OHLSSON將麥芽淀粉酶在pH 7.0，70 ℃處理15 min后發現可將麥芽β-淀粉酶完全破壞而保留α-淀粉酶，將麥芽淀粉酶在0 ℃，pH 3.3下處理15 min則α-淀粉酶被破壞而保留β-淀粉酶，說明了β-淀粉酶的耐酸性較強而α-淀粉酶則耐熱性較強，日本北原覺雄也利用酸、熱處理的方法來觀察對黑曲霉與米曲霉的淀粉酶之影響，指出黑曲霉的α-淀粉酶耐酸性較米曲霉強，而糖化酶耐熱性也比米曲霉強。為了研究所使用的菌種黑曲霉NRRL 330與米曲霉 NO.7的性質與之有何不同，我們將兩株曲霉的液體曲分別在pH 1.0～8.0，40 ℃～60 ℃不同條件下處理14 min～60 min，來觀察不同pH與溫度下對糖化酶、麥芽糖酶與α-淀粉酶的影響。結果表明，黑曲霉的糖化酶和麥芽糖酶耐酸性較強，在最適pH范圍3.0～5.0間之最適溫度為60 ℃，在pH 7.0、60 ℃處理15 min，兩種酶的活力損失也甚微，此與北原覺雄的結論不同；而米曲霉NO.7則相反，pH 4.5、60 ℃處理1 h失活后達80%以上，pH 2.5處理30 min則兩種酶活力喪失殆盡，但在pH 7.0、55 ℃處理15 min則大部分酶活力可以保存。

試驗表明,黑曲霉NRRL 330的α-淀粉酶與麥芽糖酶與米曲霉的不同，經pH 2.5、50 ℃處理15 min而不失活，但在pH 7.0、55 ℃處理卻遭破壞，黑曲霉NRRL 330的α-淀粉酶耐熱性強，最適pH 3～5.0，最適溫度60 ℃～70 ℃。

黑曲霉淀粉酶的耐酸與耐熱性對酒精發酵至少有兩大優點：

① 可在較高溫度糖化，溫度高則蒸煮醪黏度降低而有利發酵的進行。

② 在較高溫度下糖化，可節約冷卻用水，并可降低雜菌污染的機會，提高酒精收得率。

3 培養基組成份，培養條件對黑曲霉NRRL 330生產淀粉酶的影響和淀粉酶系若干酶對酒精產率的影響

以玉米、甘薯、麩皮、米糠、玉米漿、豆粕等原料，添加NaNO3、NH4Cl等無機氮源和MgSO4、CaCl2等無機鹽，配制18種不同培養基來培養黑曲霉制備液體曲，觀察不同培養基對生產淀粉酶的影響。

試驗結果表明，在各種原料中以使用玉米粉6.0%，NaNO30.3%，MgSO40.05%～0.1%的培養基組成，其糖化酶活力最高且產酶穩定在250單位以上；培養基的初始pH以4.0～4.6時為最佳。試驗也表明,初始pH的高低對生成淀粉酶的耐酸性無多大影響。雖然培養基中的含氮量對產酶有較大影響，但要因氮源不同而異。培養基中的磷含量對淀粉酶生成似無多大影響。Mg2+是植物生長必需的元素，也是發酵、呼吸鏈酶系的活化劑。向玉米培養基添加0.05%～0.1%的MgSO4可明顯促進糖化酶的生成，由221 U/mL增加到250 U/mL以上。富金源孝稱“合成培養基中添加Mg2+，對糖化酶之生成有利”，我們的實驗證明天然原料培養基中添加Mg2+也可對產酶起到促進作用。

如表3所示，影響酒精得率的酶主要是糖化酶和麥芽糖酶，可是試驗還發現雖然以玉米粉6.0%、NaNO30.3%、MgSO40.05%所組成的培養基，其糖化酶活力最高，達250 U/mL，麥芽糖酶活力在8 U/mL，但酒精發酵的結果其酒精發酵率竟與糖化酶活力僅148 U/mL，麥芽糖酶活力為7.9 U/mL的培養基(甘薯 0.5%，玉米粉 1.5%，麩皮 3%，NaNO30.1%)生產的液體曲相同，都在91%左右，估計這是由于蒸煮醪中添加的液體曲量為15%可能已過量，已遠超實際需要量之故。

表3 三種培養基制成的黑曲霉NRRL 330 液體曲糖化發酵結果

從酒精發酵醪的失重來看，凡麥芽糖酶活力強的發酵速度較快(失重多)，而麥芽糖酶活力低而α-淀粉酶活力強的液體曲發酵速度較慢，這種現象可解釋如下：麥芽糖酶強的，糖化醪中的葡萄糖生成量較多，可被酵母立即利用發酵成酒精，而液體曲之麥芽糖酶弱而α-淀粉酶強者，因糖化后所積聚的麥芽糖與糊精不能被酵母立即利用，須經過一段時間的延遲后才能被酵母發酵之故。

4 結語

60年代初國內還沒有普遍建立科研成果鑒定與驗收制度。由于液體曲的研究初告成功，酒精廠的新車間開始設計并建造，液體曲生產技術在行業交流中逐漸得到推廣和應用。隨著谷氨酸研究課題的上馬，我們單位的液體曲研究項目也就宣告結束。我們的研究報告部分內容曾在1957年《化學世界》雜志上發表，全部報告則在1959年以上海市輕工業研究所、上海酒精廠和輕工業部發酵研究所的名義，以《應用液體曲制造酒精的研究》為書名由科技衛生出版社公開發行。液體曲制酒精的研究實際上就是糖化酶的研究，但其研究的內容比糖化酶要復雜，不僅要測定其糖化酶活力，還需測定α-淀粉酶活力，麥芽糖酶活力以及酒精發酵得率等項目，而糖化酶則是將液體曲濾去菌體、培養基殘渣后，將液體曲濾液濃縮或稀釋(如發酵酶活力高的話)到一定濃度，再添加食用級防腐劑和穩定劑即為商品液態糖化酶制劑出售。

我國經過幾代人的努力，才使糖化酶的發酵產酶量達到今日之水平。如今糖化酶已廣泛應用于酒精、酒、醋、醬等釀造制品的生產，更大量地應用于淀粉糖、氨基酸、檸檬酸、酵母、抗生素、維生素等許多產品的生產上，為國民經濟的發展作出了重大貢獻。淀粉原料生產酒精的工廠早已廢棄了制曲這一工序，實現了酶法糖化，基本上實現了機械化自動化，勞動強度大大降低，簡化了生產工序，節省了人力與場地。

由于市場需要量大，我們在國家六五、七五科技攻關項目高溫淀粉酶的研究完成后，技術成果轉讓給太倉宏達電廠，并協助建立宏達制酶公司。在上世紀90年代該公司與丹麥諾維信Novozymes公司合資后，將發酵規模由100 m3擴大到1 600 m3，也因市場需要而將其全部用于糖化酶的生產，菌種是丹麥的,這個廠也已成為世界大酶制劑企業之一。