一種Zalerion arboricola發(fā)酵產物的分離、純化和結構鑒定

張 磊， 呂堅方， 邵 東， 徐作武， 王小平 浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，浙江 新昌 312500

自從第一個抗真菌藥兩性霉素B問世以來，人類與真菌感染類疾病的斗爭已經持續(xù)了半個多世紀。按照國際醫(yī)學界的通行標準，真菌感染可分為淺表性真菌感染、皮下真菌感染和系統(tǒng)性真菌感染。其中系統(tǒng)性真菌感染(即深部真菌感染)最具致命性。在預防和治療淺表性真菌感染方面，現(xiàn)代臨床醫(yī)學已取得突破。但對于皮下及深部真菌感染，因真菌抗藥性及現(xiàn)有藥物的毒副作用等原因，尚未取得顯著進展。近年來，隨著廣譜抗生素、免疫抑制劑和抗惡性腫瘤藥物的廣泛應用，開放性治療手段如器官移植、插管技術及外科介入治療的深入開展，增加了深部真菌感染的發(fā)病機率。條件致病性真菌所引發(fā)的系統(tǒng)性真菌病日益增多，如患者不能獲得及時治療，往往會病情加重甚至危機生命。[1]

臨床上治療真菌感染使用的藥物主要有兩性霉素B和唑類抗真菌藥物(如氟康唑、伊曲康唑和伏力康唑等)，但這些藥物在安全性和抗菌譜等方面均存在一些問題，因此臨床上亟待開發(fā)高效、低毒的新型廣譜抗真菌藥物。在大量試驗的基礎上，研究人員找到了對治療真菌感染有顯著療效的棘白菌素類化合物。該類化合物可抑制真菌細胞壁的β-1,3-D-葡聚糖的合成，破壞細胞壁完整性，從而發(fā)揮殺菌作用。因哺乳動物細胞無細胞壁，故該類化合物對哺乳動物細胞并無影響。進一步臨床研究表明，該類化合物與兩性霉素B和唑類抗真菌藥物無交叉耐藥性，對人體的毒性低，臨床效果較好。其中以芬凈類化合物為代表已上市多年[2]。

卡泊芬凈是以微生物發(fā)酵產物紐莫康定B0為中間體經化學合成而得。在更廣泛的相似類化合物篩選過程中，研究人員又發(fā)現(xiàn)該類化合物的其他多種類似物。這些類似物均以乙酰六環(huán)為基本結構，通過結合不同取代基，從而導致分子的抗真菌活性及代謝性質等方面表現(xiàn)出一定程度的差異[3]。

在從微生物發(fā)酵產物中篩選具有抗真菌活性化合物的過程中，除了對菌體的主要代謝產物進行研究外，還應對代謝過程中產生的其他多種化合物進行考察。在從菌體代謝產物中成功分離得到單一化合物后，再對這些化合物進行抗菌活性考察。也可以對所獲得的化合物進行結構修飾，然后再進行抗菌活性的篩選。這樣就有可能篩選得到藥效更好、不良反應更少的新活性化合物[4]。Zalerionarboricola菌體在發(fā)酵過程中除通過次級代謝可以產生紐莫康定B0之外，也會產生多種其他的結構類似物[5]。目前國內外研究主要集中在紐莫康定B0發(fā)酵工藝優(yōu)化以及發(fā)酵液中紐莫康定B0的提取純化[6-9]，對發(fā)酵過程中所產生的其他結構類似物的分離純化則鮮有報道。本文從Zalerionarboricola發(fā)酵液中分離到一個紐莫康定B0的結構類似物并進行了結構鑒定。以該化合物為基礎進行結構修飾后，就可以進一步確定修飾物的抗真菌效果[10]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株

ZalerionarboricolaHCCB30111保存于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏編號為CGMCC No.5412。

1.1.2培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基PDA(%)：葡萄糖 25，蛋白胨 0.9，瓊脂 2.0。

種子培養(yǎng)基(%)：葡萄糖 2.5，KH2PO40.9，酵母粉 0.5，泡敵 1.0，85%乳酸 0.2 mL，微量元素 0.1 mL，pH 6.0；

發(fā)酵培養(yǎng)基(%)：蔗糖 12.5，谷氨酸鈉 0.8，酵母粉 0.8，脯氨酸 1.5，KH2PO40.15，七水合硫酸鎂 0.04，泡敵 1.0，微量元素 1 mL，MES緩沖鹽 1.5，pH 5.3；

微量元素組成(g/L)：七水硫酸亞鐵 1.0，一水硫酸錳 0.2，二水氯化鈣 0.1，硼酸 0.056，二水氯化銅 0.025，四水鉬酸銨 0.019，12N鹽酸 50 mL。

1.1.3主要儀器

制備型液相色譜儀DAC 50(江蘇漢邦科技有限公司)，1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，6520 Q-TOF液質聯(lián)用系統(tǒng)(美國Agilent公司)，核磁共振波譜儀DMX400(德國布魯克公司)，旋轉蒸發(fā)儀YRE-201D(鞏義予華儀器公司，中國)，實驗型凍干機FD-80(北京博醫(yī)康科技有限公司)。X3色譜填料(10 μm,大連化學物理研究所)；C18色譜填料(10 μm，蘇州納微科技有限公司)。XAD-1180N大孔吸附樹脂(陶氏化學公司，美國)。

1.1.4試劑

乙醇(分析純)購自安徽安特食品股份有限公司。丙酮(分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司。乙腈(分析純)購自星可化學科技(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1高效液相色譜法(HPLC)檢測條件

色譜柱：Phenomenex kinetex C18 (2.6 μm,1.7 mm×150 mm)；流動相：乙腈∶水=40∶60；流速：0.8 mL/min；檢測波長：220 nm；柱溫：35 ℃。

1.2.2質譜檢測條件

直接進樣模式，電噴霧電離源(ESI)正離子檢測，裂解電壓135 V，離子源溫度230 ℃，氣體流速：8.0 L/min,樣品濃度1 mg/mL。

1.2.3核磁共振檢測條件

測試條件為CD3OD；觀察頻率100 MHz，掃描范圍-20 ppm～220 ppm。采樣時間0.68 s，延遲時間2 s，掃描次數5 120次，測定溫度300 K。

1.2.4紐莫康定B0(Pneumocandin B0)發(fā)酵液的制備

斜面培養(yǎng)條件：28 ℃，5 d；種子培養(yǎng)條件：挖塊接種，25 ℃，220 r/min ，3 d；發(fā)酵條件：轉種量10%，25 ℃，220 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)7 d。

1.2.5固液分離及粗品的制備

紐莫康定B0發(fā)酵液為實驗室自制[11]。發(fā)酵液30 L用陶瓷膜過濾濃縮至15 L；第一次萃取在濃縮液中加入15 L乙醇，在陶瓷膜循環(huán)罐循環(huán)30 min后用陶瓷膜過濾至約10 L；第二次萃取再次加入20 L 50%乙醇-水溶液，在陶瓷膜循環(huán)罐循環(huán)30 min后用陶瓷膜過濾至約10 L；第三次萃取再次加入20 L 50%乙醇-水溶液，在陶瓷膜循環(huán)罐循環(huán)30 min后用陶瓷膜過濾至約10 L結束操作。每次萃取濾液都用大孔吸附樹脂(樹脂柱體積200 mL)吸附萃取液中目標產物。

吸附后的樹脂柱用40%乙醇預洗，洗下色素類雜質及其它吸附不牢的雜質；再用70%乙醇解析，分段收集解析液。利用液相檢測后，合并含高濃度目標產物的解析液，然后加入1倍體積的活性炭脫色。過濾除去活性炭后，脫色液45 ℃減壓濃縮除乙醇，得到含有目標組份的固液混合物，凍干后得到粗品。

1.2.6目標化合物的富集

目標化合物的富集使用DAC 50制備柱(裝入X3色譜填料約500 mL)進行。粗品溶解于85%丙酮-水溶液中(濃度為每毫升液體溶解0.1 g粗品)，制備時每次進樣體積 50 mL，流動相為丙酮∶水=85∶15，進樣后可以根據在線圖譜監(jiān)測組份層析情況，目標組分出現(xiàn)色譜吸收峰后分段收集，收集完成后結束本次制備分離，進行第二次制備，重復進樣-分段收集操作，直至積累足夠的樣品。每次制備的分段收集液用HPLC檢測，合并純度≥75%的部分作為有效層析液，45 ℃減壓濃縮除丙酮后進入下一步。

1.2.7純化

使用裝C18色譜填料(約500 mL)的DAC 50制備柱進行純化。上一步得到的料液，按照體積加入60%的乙腈，全部溶解后作為本步料液。制備時每次進樣體積25 mL，流動相為乙腈∶水=65∶35，進樣后可以根據在線圖譜監(jiān)測組份層析情況，目標組分出現(xiàn)色譜吸收峰后分段收集，收集完成后結束本次制備分離，進行第二次制備，重復進樣-分段收集的的操作，直至積累足夠的樣品。每次制備的分段收集液用HPLC檢測，合并純度≥95%的部分作為有效層析液，45 ℃減壓濃縮除乙腈后，進行后處理。

1.2.8后處理

純化后的合格收集液，45 ℃減壓濃縮除去乙腈后進行凍干，得到目標化合物樣品。

2 結果與分析

2.1 目標化合物的高分辨質譜數據

對目標化合物進行質譜檢測，條件為電離源(ESI)正離子模式。對目標化合物的主要信號峰進行分析，結果如圖1和表1所示。目標化合物的準分子離子峰[M+H]+為1 065.580 9，元素組成為C50H81N8O17；1 047.566 7峰為目標化合物脫去OH基團的信號峰；1 065.581 2、1 067.566 4為目標化合物準分子離子的同位素信號峰。

圖1 目標化合物的高分辨質譜圖

表1 目標化合物的高分辨質譜檢測數據

2.2 目標化合物的核磁共振譜數據

對目標化合物進行核磁共振檢測，測試條件為CD3OD。所得核磁檢測譜圖包括：圖2(目標化合物核磁共振檢測1H譜)；圖3(目標化合物的核磁共振檢測13C譜)；圖4(目標化合物的核磁共振檢測COSY譜)；圖5(目標化合物的核磁共振檢測HMBC譜)；目標化合物核磁共振檢測的1H和13C-NMR數據匯總見表2。

2.3 目標化合物結構解析

按照樣品的結構，殘基可分為3-OHPro、OHGln、DiOHTyr、4-OHPro、Thr、DiOHPro和DMM七個部分。對核磁相關譜圖(圖2和圖3)進行分析表明：該化合物有4個甲基、16個亞甲基(其中2個連N原子，分別為3-OHPro 中的C-5和4-OHPro中的C-5)、 16個是次甲基(7個氧代，6個氮代，1個氧氮二元代)、 1個二取代的苯環(huán)、8個羰基碳。1H、13C-NMR數據(表1)和二維相關光譜表明該化合物是一個pneumocandin A0類似物，具有2個羥基脯氨酸(3-OHPro和4-OHPro)、1個二羥基酪氨酸類似物(DiOHTyr)、1個羥基谷氨酰胺(OHGln)、1個蘇氨酸(Thr)、一個二羥基脯氨酸(DiOHPro)和1個二甲基肉豆蔻酸。通過COSY和HMBC相關譜(圖4和圖5)，連接得到了該化合物的平面結構。

表2 目標化合物的核磁共振檢測1H和13C-NMR數據匯總

圖2 目標化合物核磁共振檢測1H譜圖

圖3 目標化合物核磁共振檢測13C譜圖

COSY譜(圖4)顯示化合物有下列5個自旋偶合相關體系：3-OHPro: 2-CH→3-CH→4-CH2→5-CH2；OHGln: 2-CH→3-CH→4-CH2；DiOHTyr: 2-CH→3-CH→4-CH和2’/6’-CH→3’/5’-CH；4-OHPro: 2-CH→3-CH2→4-CH→5-CH2；Thr: 2-CH→3-CH→4-CH3；DiOHPro: 2-CH→3-CH2→4-CH→5-CH；DMM: 2-CH2→3-CH2→4-CH2→5-CH2→6-CH2→7-CH2→8-CH2→9-CH2→10-CH→11-CH2→12-CH→13-CH2→14-CH3。【備注：此段組織成合適的閱讀結構】

圖4 目標化合物核磁共振檢測COSY譜圖

1H-13C-NMR遠程偶合相關譜(圖5)表明：3-OHPro中2-H和5-H2與OHGln中的1-C相關，表明OHGln通過酰胺鍵與3-OHPro相連；OHGln中2-H與DiOHTyr中的1-C相關，表明DiOHTyr通過酰胺鍵與OHGln相連；DiOHTyr中2-H與4-OHPro中的1-C相關，表明4-OHPro通過酰胺鍵與DiOHTyr相連；4-OHPro中2-H和5-H2與Thr中的1-C相關，表明Thr通過酰胺鍵與4-OHPro相連；Thr中2-H與DiOHPro中的1-C相關，表明DiOHPro通過酰胺鍵與Thr相連；DiOHPro中2-H與DMM中的1-C相關，表明DMM通過酰胺鍵與DiOHPro相連。

圖5 目標化合物核磁共振檢測HMBC譜圖

通過COSY和HMBC的二維相關，把各基團相連，得到化合物的完整結構，如圖6所示：

圖6 紐莫康定6b的分子結構

3 結論與討論

本文以Zalerionarboricola菌體發(fā)酵液為原料，依次通過陶瓷膜固液分離，大孔樹脂吸附目標產物，解析后活性炭脫色，減壓濃縮除去溶劑后凍干得到粗品。粗品溶解后，用X3色譜填料進行目標化合物的層析富集，含量合格的層析液進行減壓濃縮，得到富集后的目標化合物樣品。再次溶解后，用C18色譜填料進行目標化合物的層析純化，含量合格的層析液進行減壓濃縮，凍干后得到目標化合物樣品。最后通過高分辨質譜、核磁共振檢測對目標化合物進行結構鑒定。通過對鑒定時得到的1H和13C-NMR數據進行分析匯總，并和文獻報道的1H和13C-NMR數據進行比對，兩者信息一致；再通過COSY和HMBC的二維相關，把各基團相連，得到化合物的完整結構，也和文獻報道的結構一致，可以確認該化合物為紐莫康定6b。[12]

制備得到目標化合物后，有多方面的實際意義。首先，以該化合物的含量作為一個檢測指標，可以優(yōu)化發(fā)酵工藝參數，控制發(fā)酵產物中紐莫康定6b的比例，從而降低隨后的純化工藝的難度，提高生產效率，降低生產成本，為大規(guī)模工業(yè)化生產提供技術支持；其次，在紐莫康定6b的基礎上，可以進行化學合成，通過結構修飾，連接不同取代基團后在進行生物活性的篩選，有可能得到潛在的抗菌活性更好的化合物。