血管內皮生長因子和性別決定區(qū)Y-17對慢性心力衰竭的診斷價值

申達甫，何志偉

1.上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院心血管外科，上海200127；2.上海郵電醫(yī)院普外科，上海200040

心力衰竭是一種十分常見的臨床綜合征，以呼吸困難、容易疲勞和容量負荷過重為特征，可以出現(xiàn)外周水腫和肺啰音等體征[1-2]。心力衰竭的癥狀可由收縮或舒張功能障礙引起。心力衰竭的發(fā)病率和死亡率很高，特別是在老年人中[3-4]。我國每年約新發(fā)心力衰竭患者50 萬例[5]。許多疾病，如冠狀動脈疾病、高血壓、心臟瓣膜病和糖尿病，可引起或導致慢性心力衰竭失代償。慢性心力衰竭患者需要長期進行藥物治療和隨訪，不斷增加患者以及社會負擔。高發(fā)病率和不良預后使得對該疾病的早期診斷和及時治療尤為重要。慢性心力衰竭的診斷需要依據(jù)病史和體格檢查、胸片、心電圖、心臟彩超和實驗室檢查等。目前并沒有單一診斷試驗可以確診慢性心力衰竭。具有高靈敏度、高特異度的血清學標志物可以應用于早期非侵入性的篩查。近年來，隨著實驗技術的進步，不斷發(fā)現(xiàn)新的血清標志物可以用于慢性心力衰竭的診斷或者風險分層。這些標志物往往具有自身特異性，并且與特異的疾病的致病機制通路相關。聯(lián)合應該這些指標可以提高診斷效能，包括特異度和靈敏度[6-8]。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）與性別決定區(qū)Y-17（sex determining region Y-box 17,SOX17）均被證實與心力衰竭相關[9-10]，是可能用于心力衰竭診斷的潛在標志物。本研究旨在探索，VEGF與SOX17 作為血清學標志物在慢性心力衰竭診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 招募2020年1月—2021年1月在上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院住院治療的慢性心力衰竭患者50 例，設立為觀察組，50 名健康者設立為對照組。觀察組納入標準：（1）根據(jù)患者臨床癥狀、體格檢查結果、輔助檢查結果，診斷為慢性心力衰竭，診斷標準參照中華醫(yī)學會心血管病學會心力衰竭學組2018 版《中國心力衰竭診斷和治療指南2018》[11]；（2）患者病程超過半年以上；（3）患者年齡在60 歲至75歲之間；（4）患者知曉本研究內容與意義，自愿參加本研究本簽署知情同意書。觀察組排除標準：（1）合并惡性腫瘤者；（2）合并急慢性感染者；（3）合并精神心理類疾病，不能正常交流者；（4）近半年內參與其他臨床試驗者。對照組入組標準：（1）既往無心腦血管疾病病史；（2）健康者年齡在60 歲至75 歲之間；（3）使用抗VEGF 藥物患者；（4）患者知曉本研究內容與意義，自愿參加本研究本簽署知情同意書。對照組排除標準參照觀察組。本研究通過上海仁濟醫(yī)院倫理委員會審核批準。記錄患者的一般資料，包括年齡、性別、平均身高、體重、收縮壓、舒張壓、吸煙史、飲酒史、糖尿病病史。記錄患者N 末端B 型利鈉肽前體(NT-proBNP) 和超聲心動圖參數(shù)（每搏量和射血分數(shù)）。

1.2 觀察指標檢測 本研究使用人血清VEGF 酶聯(lián)免疫試劑盒（德國merck-millipore 公司，貨號：QIA51-1EA）和SOX17 酶聯(lián)免疫試劑盒（美國raybiotech 公司，貨號：ELH-SOX17-2）。取患者早晨空腹血樣5mL，經離心機（德國BAXIT 公司，型號：BXTGL16M）離心后，分離上層血清。使用包被稀釋液稀釋好的抗原在96 孔板上進行加樣，每孔加入100 L。在4℃的環(huán)境中放置24 h。放置時要求物理封閉96 孔板，防止液體蒸發(fā)。完成上述步驟之后，丟棄96 孔板中液體。使用小牛血清封閉酶標反應孔，封閉時間應超過40 min。本研究要求封閉時，血清加滿反應孔，放置于37℃的恒溫箱中。封閉完成后充分洗滌反應孔。將待檢測血清建立合適濃度梯度后加入孔板，重復3 次。本研究要求放置于37℃的恒溫箱中，時間為1 h。上述步驟完成后充分洗滌反應孔。加入酶標抗體，放置于37℃的恒溫箱中，反應時間為1 h。最后加入底物液TMB-過氧化氫尿素溶液，放置于37℃的恒溫箱，避光反應3 min。終止反應，并使用酶標儀測量吸光度，計算所測目標因子血清含量，取3 次測量平均值。

1.3 統(tǒng)計學分析 本研究中所用統(tǒng)計學數(shù)據(jù)使用R 軟件（V3.5.1）和相關R 包進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用獨立樣本 檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示，采用卡方檢驗。通過Logistic 回歸分析篩選慢性心力衰竭獨立危險因素并建立聯(lián)合診斷指標。通過受試者工作特征(Receiver operatingcharacteristic，ROC) 曲線評估VEGF、SOX17、以及聯(lián)合指標診斷效能。使用STRING 11.0 構建VEGF、SOX17 為核心的蛋白相互作用網(wǎng)絡。利用京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路數(shù)據(jù)庫和PathView軟件對VEGF、SOX17 相關的基因進行信號通路富集分析。<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2 組之間一般情況比較 本研究觀察組和對照組一般情況如表1 所示，2 組之間在平均年齡、性別、平均身高、體重、收縮壓、舒張壓、吸煙史、飲酒史、糖尿病史等方面差異無統(tǒng)計學意義（>0.05）。50 例心衰患者中18（36.00%）例患冠心病、13（26.00%）例患高血壓病、6（12.00%）例患心肌炎、5（10.00%）例患有擴張性心肌病、10（20.00%）例患有瓣膜病。2 組之間NT-pro BNP 和超聲心動圖參數(shù)之間差異有統(tǒng)計學意義（<0.001）。見如表2。

表1 2 組基線情況比較

表2 2 組NT-pro BNP 和超聲心動圖參數(shù)比較

2.2 2 組之間VEGF 與SOX17 血清含量差異 對照組VEGF 血清含量（72.29±37.20） pg/mL，觀察組VEGF 血清含量（122.73±67.85）pg/mL；觀察組VEGF血清含量高于對照組（<0.001）。對照組SOX17血清含量（94.80±49.49）pg/mL，觀察組SOX17 血清含量（142.34±87.64）pg/mL；觀察組SOX17 血清含量高于對照組（<0.001）。見圖1。

圖1 對照組和觀察組血清VEGF、血清SOX17 含量差異比較

2.3 Logistic 回歸分析本研究以慢性心力衰竭患病情況為因變量，SOX17 和VEGF為自變量，進行Logistic回歸分析。結果表明，SOX17（OR=1.32,95%[0.96,1.36]）和VEGF（OR=1.41,95%[1.06,1.62]）是慢性心力衰竭的獨立危險因素（<0.05）。見表3。

表3 血清SOX17、VEGF 含量Logistic 回歸分析

本研究基于SOX17 和VEGF 構建風險值計算公式：風險值=-2.96+0.01×SOX17 血清含量+0.02×VEGF 血清含量。ROC 曲線表明，SOX17 曲線下面積（area under the curve,AUC）為0.67，95%CI 為[0.57,0.76]，最佳臨界值為115.89 pg/mL，敏感度為48%，特異度為82%。VEGF 的AUC 為0.76，95%CI 為[0.67,0.84]，最佳臨界值為79.32 pg/mL，敏感度為76%，特異度為74%。風險值的AUC 為0.81，95%CI 為[0.72,0.88]，最佳臨界值為0.60，敏感度為78%，特異度為82%。此外，本研究還納入了NTpro BNP 作為參照，其AUC 為0.762，小于風險值AUC，表明聯(lián)合指標風險值診斷效能優(yōu)于NT-pro BNP。

圖2 VEGF、SOX17 血清含量對慢性心力衰竭診斷受試者工作特征曲線（Receiver operating characteristic，ROC）

2.4 SOX17、VEGF 蛋白質相互作用網(wǎng)絡構建 本研究構建了SOX17、VEGF 蛋白質相互作用網(wǎng)絡。見圖3。

圖3 SOX17、VEGF 蛋白質相互作用網(wǎng)絡。線條越粗表示相互間作用關系支持越強

2.4 KEGG 通路富集 分析本研究將SOX17、VEGF及相互作用蛋白質進行KEGG 通路富集。結果顯示，SOX17、VEGF 及相互作用蛋白質基因主要富集在鈣信號通路、擴張型心肌病、糖酵解和糖質新生、松弛素信號通路、ECM 受體交互、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、PI3K-Akt 信號通路、細胞凋亡、HIF-1 信號通路、蛋白質消化吸收等信號通路上（<0.05）。見圖4。

圖4 SOX17、VEGF 及相互作用蛋白質進行KEGG 通路富集分析

3 討論

心力衰竭被美國心臟協(xié)會和美國心臟病學會定義為一種復雜的臨床綜合征，可由任何結構性或功能性心臟疾病導致，損害心室充血或輸出血液的能力。由于心肌受到壓力，心輸出量減少，交感神經和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的激活增加了血壓(組織灌注) 和血容量(通過Frank-Starling 機制增加前負荷、搏出量和心輸出量)。這些代償機制也可導致進一步的心肌惡化和心肌收縮性惡化。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)了一些可以用于慢性心力衰竭的診斷血清學標志物，包括生長刺激表達因子-2、半乳糖凝集素-3、生長分化因子-15 等，但是均未廣泛應用于臨床實踐中[12]。本研究旨在探索，VEGF 與SOX17 作為血清學標志物在慢性心力衰竭診斷中的價值。

本研究通過ELISA 的方法測定了慢性心力衰竭患者和健康受試者血清中VEGF、SOX17 血清中的含量。研究發(fā)現(xiàn)，慢性心力衰竭患者VEGF 血清含量高于健康受試者。這一結果得到了既往研究和文獻的支持，慢性心力衰竭患者血清中VEGF 水平升高，經過治療之后有所降低[13-14]。慢性心力衰竭患者血清中SOX17 血清含量高于健康受試者。SOX17 與慢性心力衰竭之間的關系尚缺乏相關研究闡明，本研究這一結果需要進一步擴大樣本量進行證實。

本研究通過Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，SOX17 和VEGF 是慢性心力衰竭的獨立危險因素，并且構建了風險值計算公式，并進一步探索了VEGF、SOX17 以及兩者的聯(lián)合診斷效能。ROC 曲線表明，SOX17、VEGF、風險值的AUC 分別為0.67、0.76、0.81，最佳臨界值以及對應的敏感度和特異度分別為115.89 pg/mL（0.48,0.82）、79.32pg/mL（0.76,0.74）、0.60（0.78,0.82）。上述結果表明，VEGF 和SOX17 均可以獨立應用于慢性心力衰竭的診斷，并且診斷效能良好。VEGF 和SOX17 聯(lián)合構建的風險值作為診斷指標，其效能高于兩者獨立作為診斷指標。此外，本研究還納入了NT-pro BNP 作為參照，其AUC 為0.762，小于SOX17 和VEGF 聯(lián)合指標風險值AUC，表明聯(lián)合指標風險值診斷效能優(yōu)于NT-pro BNP。

本研究構建了SOX17、VEGF 蛋白質相互作用網(wǎng)絡，并且對相互作用基因進行了KEGG 通路富集分析。富集分析結果表明，SOX17、VEGF 及相互作用蛋白質基因主要富集在鈣信號通路、擴張型心肌病、糖酵解和糖質新生、松弛素信號通路、ECM 受體交互、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、PI3K-Akt 信號通路、細胞凋亡、HIF-1 信號通路、蛋白質消化吸收等信號通路上。值得注意的是這些通路之中，HIF-1在心衰的致病過程中發(fā)揮重要作用，HSF1 缺陷通過內皮細胞mir-195a-3p 介導的心臟血管生成損傷，加速了壓力超載誘導的心肌肥肥大向心力衰竭的轉變[15]。也有研究證實P53 的缺失部分通過抑制HIF1 信號傳導來逆轉壓力過載引起的心臟重構[16]。鈣信號通路、擴張型心肌病信號通路同樣被證實在慢性心力衰竭致病過程中發(fā)揮重要作用[17]。相關研究還表明細胞凋亡與心力衰竭發(fā)生進展相關。miR-122 心臟特異性過表達誘導線粒體依賴的心肌細胞凋亡并通過抑制Hand2促進心力衰竭[18]。構建蛋白質相互作用網(wǎng)絡以及KEGG通路富集分析得出的結果，可以為慢性心衰的致病機制提供新的思路，發(fā)現(xiàn)潛在的生物學標志物和新的治療靶點。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，VEGF 和SOX17 均可以獨立應用于慢性心力衰竭的診斷，并且診斷效能良好。VEGF 和SOX17 聯(lián)合構建的風險值作為診斷指標，其效能高于兩者獨立作為診斷指標，值得在臨床應用中進行推廣。