γ-氨基丁酸A型受體相關蛋白在老年胰腺導管腺癌患者胰腺癌組織中的表達與其臨床意義

王偉藝，唐文皓，張超，袁祖榮，唐健雄，姜翀弋，涂彥淵，吳兆坤

復旦大學附屬華東醫院普外科，上海200040

胰腺導管腺癌是最多見的胰腺惡性腫瘤，惡性程度極高，其預后極差。2019年Cancer Statistics 雜志數據顯示美國胰腺癌5年生存率僅9%，轉移性胰腺癌患者5年生存率3%，是美國死亡率第4 位的惡性腫瘤[1]。近年來，胰腺癌快速上升至中國惡性腫瘤死亡率第六位，其5年生存率不足8%[2]，且老年患者胰腺癌較高發，大多合并肝、腎、肺、心等臟器功能衰退，手術及化療耐受性差，預后更差。因此，尋找老年胰腺癌術后復發轉移的預測因素，是提高胰腺癌療效迫切需要的解決方法。Klebig C 等[3]研究表明，與正常乳腺組織相比，原發性乳腺癌組織中γ-氨基丁酸A 型受體相關蛋白（GABARAP）的mRNA 和蛋白水平較低，并且在低表達的乳腺癌細胞系中異位表達GABARAP 基因會降低腫瘤的生長速度。GABARAP 的這種抑瘤特性可以通過對自噬的直接作用和通過控制表皮生長因子（EGFR）[4-5]等受體的轉運間接介導，提示GABARAP 可能與腫瘤的發生發展密切相關，但仍有很多爭議。為此，本研究旨在探討GABARAP 與老年胰腺導管腺癌根治術后預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月—2018年12月在復旦大學附屬華東醫院普外科行胰腺癌根治術并經病理證實為胰腺導管腺癌的老年病例60 例，其中男性40例，女性20 例；年齡60～84 歲,平均(68.7±5.9) 歲。所有病例均有完整的隨訪資料，隨訪的截止日期為2020年12月31日。排除標準為圍術期死亡和切緣陽性的病例。60 例老年胰腺導管癌患者一般資料見表1。

表1 60 例老年胰腺導管腺癌患者臨床資料

1.2 免疫組化 采用MaxVision 免疫組化法，檢測標本取自于根治手術的胰腺癌組織以及配對癌旁正常胰腺組織。根據病理科檔案選取包含腫瘤組織的蠟塊及包含正常胰腺組織的蠟塊數枚，分別切片，行HE 染色，顯微鏡下觀察有無腫瘤組織及正常胰腺組織，選取腫瘤組織與非腫瘤組織界限分明、組織豐富的蠟塊。將蠟塊切片，且下的蠟塊薄片輕輕放入漂烘儀熱水中，使其漂浮，燙平，然后將蠟塊薄片附著于載玻片上，待水流干，放65℃電熱恒溫箱中烘干1 h。選擇Lumatas全自動免疫組化染色儀附帶電腦內的染色程序，用標簽打印機打印出標簽，該標簽與待執行的抗體模板相對應。將打印出的標簽貼在已完成烤片的玻片一端，再將玻片放入染色儀的染色架上。將裝有脫蠟液、一抗、二抗、DAB 的試劑盒放在試劑架上。將抗原修復液、緩沖液、酒精、蒸餾水放入儀器中相應容器內。進入儀器操作軟件，掃描切片標簽和試劑標簽后，全自動免疫組化染色儀自行完成脫蠟、水化、修復、加入一抗、加入二抗、DAB 顯色等步驟，運行結束后取出玻片。取下載玻片，用蘇木精復染：清水沖洗，蘇木素染色10～30 s，PBS 溶液、氨水或自來水返藍。脫水：分別置入85%乙醇中、95%乙醇中及無水乙醇中，各浸泡3 min；透明：使用二甲苯進行透明封片：使用中性樹膠封片。鏡檢。

1.3 GABARAP 陽性結果判定 陽性對照為已知胰腺癌陽性玻片，陰性對照為TW-0821 緩沖液代替GABARAP 鼠多克隆抗體。胰腺癌或癌旁胰腺細胞胞質中觀察到棕黃色的顆粒，則判定為該細胞GABARAP 陽性。將切片置于400 倍鏡下觀察，結合細胞染色強度分析并計算呈棕黃色的陽性細胞個數與視野中所有細胞個數的比值，至少計算10 個視野，綜合比值>25%判定該標本為陽性。

1.4 統計學分析 使用SPSS26.0 統計軟件進行統計學分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，采用檢驗；計數資料用例數和百分率表示， 組間比較采用卡方檢驗； Kaplan-Meier 和Log-rank 檢驗進行單因素分析，尋找可能影響胰腺癌導管腺癌預后的危險因素，采用Cox 回歸模型分析篩選影響胰腺癌根治術后預后的因素。<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GABARAP 的表達及其與胰腺導管腺癌臨床病理關系 GABARAP 在老年胰腺導管腺癌組織中的陽性表達率為58.3%（35/60）,而在癌旁正常胰腺組織中的陽性表達率為15.0%（9/60），差異有統計學意義（<0.001)（見圖1）。而與腫瘤部位、腫瘤最大徑、淋巴結轉移、血管侵犯、神經侵犯、病理分級、腫瘤T NM 分期（AJCC2017）以及性別差異無統計學意義（均>0.05）。

圖1 GABARAP 在胰腺癌及癌旁正常胰腺組織的免疫組化表達情況

2.2 胰腺導管腺癌根治術后預后情況 本研究中胰腺導管腺癌根治術患者共60 例，隨訪的截止日期為2020年12月31日,總共48 例患者出現復發轉移，當中局部復發的比例為29.2%（14/48）,遠處轉移的比例為66.7%（32/48），局部復發和遠處轉移都有的患者的比例為14.6%（7/48）。60 例患者的無病中位生存期為17.7 個月，平均為（21.1±13.4）個月。現在仍有18 例患者存活，1 例失訪。60 例患者中位總生存期為24.0 個月，平均為（24.3±12.4）個月。1年、2年、3年累計總生存率為80.0%、46.7%、32.6%。

2.3 GABARAP、臨床病理因素（腫瘤位置、腫瘤最大徑、淋巴結轉移、病理分級、TNM 分期、性別和是否術后輔助化療）與老年胰腺導管腺癌根治術后預后的關系 Kaplan-Meier 生存分析表明（見表2），Logrank 檢驗發現25 例GABARAP 陰性與35 例GABAR AP 陽性老年胰腺導管腺癌根治術后患者的無病生存期、總生存期差異均有統計學意義（分別為=0.023、=0.012，均<0.05）（見圖2）。單因素生存分析提示：血管侵犯（=0.027）、神經侵犯（=0.044）同樣與胰腺導管腺癌根治術后的無病生存期差異有統計學意義（<0.05)。同樣，單因素生存分析結果表明輔助化療（=0.016）亦與胰腺導管腺癌根治術后總生存期差異有統計學意義（<0.05)。

表2 GABARAP 與老年胰腺導管腺癌根治術后無病生存期、總生存期的關系

2.4 Cox 回歸模型分析結果 Cox 回歸多因素分析結果提示，GABARAP（=0.013)、血管侵犯（=0.016)與術后輔助化療（=0.011) 與胰腺導管腺癌根治術后的無病生存期差異均有統計學意義（見表3）,但神經侵犯和胰腺導管腺癌根治術后的無病生存期差異無統計學意義。在總生存期上，GABARAP（=0.002)、血管侵犯（=0.034) 與術后輔助化療（=0.001) 亦與胰腺導管腺癌根治術后總生存期差異有統計學意義。見表4。

表3 老年胰腺導管腺癌根治術后無病生存期危險因素Cox 回歸模型多因素分析結果

表4 老年胰腺導管腺癌根治術后總生存期危險因素Cox 回歸模型多因素分析結果

3 討論

GABARAP是自噬相關蛋白Atg8 家族成員之一，是哺乳動物酵母Atg8 基因的同源物，其基因位于17號染色體17p13.1 的后鏈上，基因大小為1.5kb，該基因編碼GABA（A）受體相關蛋白，在自噬過程中參與了自噬體的形成，相比于人體其他器官組織GABARAP 在胰腺組織中表達較少[6]。Joachim J 等[7]研究發現GABARAP在饑餓誘導的自噬激活中特異性地與ULK1 的LIR（LC3 交互區域）基序直接相互作用，從而促進了激活ULK復合物來維持自噬體的生長。與周圍胰腺組織相比，大多數胰腺導管腺癌組織樣本的血管相對較少。增殖的癌細胞比周圍的非癌細胞需要更多的營養，盡管營養是通過功能結構上不成熟的新血管提供的。由于自主增殖的癌細胞經常暴露在缺氧條件下，自噬是缺氧應激下惡性轉化的標志，研究推測胰腺癌細胞的重要過程可能是自噬，缺氧已被報道為胰腺癌預后不良的標志[8-9]。Yang S 等[10]研究表明胰腺癌依賴于自噬，胰腺癌的細胞系與原發腫瘤在基礎的條件下自噬水平上升。自噬的遺傳或藥理抑制導致活性氧增加，DNA 損傷增加，代謝缺陷引起線粒體氧化磷酸化下降。在胰腺癌異種移植和遺傳小鼠模型中，通過氯喹治療或遺傳手段遏制自噬可引起腫瘤的穩定消退和延長生存期。Fujii S 等[11]研究發現胰腺癌周圍組織高水平自噬強烈提示患者不良的預后。以上研究提示自噬在胰腺癌發展過程中的促癌作用。然而當自噬被過度激活，大量大分子物質、細胞器等被降解也會導致細胞程序性死亡也是抑制胰腺癌細胞的一種方式。有研究表明吉西他濱及電離輻射等治療措施可激活胰腺癌細胞自噬并誘導胰腺癌細胞自噬性死亡[12]。在最近的一項研究中,Rosenfeldt M T 等[13]用轉基因的胰腺導管腺癌模型表明,TP53 突變存在時抑制自噬可促進癌癥的形成，TP53 狀態的表征將有助于識別新診斷的胰腺導管腺癌患者，他們可能從自噬抑制劑中獲益最多。Miao Y 等[14]探討了GABARAP 與結腸癌預后的關系，結果提示結直腸癌中GABARAP 表達升高與低分化、總生存期縮短相關，GABARAP 的高表達與預后有關，提示GABARAP 在結腸癌上可能為促癌基因。另外，有一項研究表明與正常乳腺組織相比，原發性乳腺癌組織中GABARAP的mRNA 和蛋白水平較低，并且在低表達的乳腺癌細胞系中異位表達GABARAP基因會降低腫瘤的生長速度，提示GABARAP 在乳腺癌上可能為抑癌基因[3]。如今的研究成果提示GABARAP表達可能與胰腺癌的自噬相關，因此本研究使用免疫組化的方法檢測GABARAP 在老年胰腺導管腺癌組織和配對的癌旁正常胰腺組織的表達。

本研究結果表明GABARAP 在60 例老年胰腺導管腺癌組織中的陽性率（58.3%）高于在癌旁胰腺正常組織中的陽性率（15.0%），差異有統計學意義（<0.001）。目前尚無相關文獻研究GABARAP 在胰腺癌及正常胰腺組織上的表達。所以，本研究推測GABARAP可能是老年胰腺導管腺癌的一個特異性的生物標志物，本研究進一步分析GABARAP 與臨床因素的關系，探討GABARAP 是否與老年胰腺導管腺癌術后復發轉移相關。

本研究進一步將GABARAP表達分為陽性組和陰性組，探討GABARAP 表達和胰腺導管腺癌根治術后的無病生存期、總生存期的相關性，結果顯示GABARAP 陽性表達的胰腺導管腺癌患者的無病生存期（28.9±3.2）個月，高于陰性表達的患者（17.3±2.5）個月，GABARAP 表達陽性的胰腺導管腺癌患者的總生存期（34.5±3.1）個月，均高于陰性患者的（21.0±2.5）個月，差異有統計學意義（<0.05）。鑒于導致胰腺癌預后差的因素眾多，進一步的胰腺癌預后關鍵因素的多因素回歸分析，GABARAP 均是影響胰腺導管腺癌根治術后的無病生存期與總生存期的獨立影響因素，而且GABARAP 表達水平和胰腺導管腺癌的預后相關，GABARAP陽性表達者無病生存期長，預后好。在本研究中,術后輔助化療（=0.001) 和血管侵犯（=0.034) 也是胰腺導管腺癌根治術后患者無病生存期獨立的影響因素。結合本研究結果，初步考慮GABARAP 為抑癌基因，與之前KlebigC 等[3]研究一致，GABARAP 在分子生物學層面具體通過自噬或其他機制抑制胰腺癌發展的作用機制，尚需進一步研究。胰腺癌好發于老年患者，年輕患者較少，故本研究著重研究GABARAP 在60 歲以上老年胰腺導管腺癌的表達情況，后續將擴大樣本量，包括添加年輕胰腺癌患者樣本加以研究。

綜上所述，GABARAP 在老年胰腺導管腺癌組織中高表達，并與老年胰腺導管腺癌根治術后無病生存期、總生存期正相關，GABARAP 可能是預測老年胰腺導管腺癌預后的生物標記物，但GABARAP 具體通過哪些分子機制影響于胰腺導管腺癌還有待進一步的實驗研究。