石竹和瞿麥組織培養與試管開花技術研究

鄒歡歡，程明圣，黃孝風，陳慧晶，肖 麗，張 云，鄒 娜

（江西農業大學園林與藝術學院，江西南昌330045）

石竹（Dianthus chinensis）為石竹科石竹屬的多年生草本植物。石竹在園林綠化中，常作為1、2年生草本花卉栽培[1]，其花朵繁密，花色艷麗，常以叢栽或成片栽植的方式應用于各種園林景觀，或作切花使用，起到美化環境及提升景觀的觀賞性的作用[2]。近年來，隨著人們生活水平和對生存環境質量要求的提高，對石竹的需求量也越來越大，但是傳統的園藝栽培中，常采用扦插、分株等繁殖方法，存在品種退化和繁殖系數低的問題，難以滿足市場巨大的需求量。重瓣瞿麥（Dianthus superbus‘Chongban’）為江西農業大學花卉盆景教學基地篩選培育出的的重瓣新品種，花色艷麗且花期長，但無結實能力[3]。瞿麥花朵繁密，花色艷麗，作為地被植物來栽培易成活，常以叢栽或成片栽植的方式應用于各種園林景觀，是園林綠化的重要組成部分。研究表明瞿麥具有抗菌、腎保護、抗腫瘤、神經保護等藥理作用[4]。采用分株和播種繁殖方式的繁殖系數較低，難以形成瞿麥的大規模生產，且分株繁殖易造成病毒的積累。組織培養技術可有效的縮短繁殖時間，短期內繁殖大量優質種苗，在提高繁殖速度、縮短育種周期、降低成本上起到了重要作用，尤其在是一些新品種的選育、擴繁和保持優良品種的特性方面更顯示出優越性[5,6]。試管開花是指通過組織培養的方法，使植物的開花過程在培養容器中完成。多數研究表明，離體條件下有助于調控植物開花的各個因素，深入研究植物開花的生理機制，以控制花期從而獲得大量成花[7]。通過分析以往人們對石竹組織培養的研究，發現石竹試管苗開花研究甚少，而且瞿麥試管開花尚未見報道。為此，本文通過對石竹和瞿麥離體培養技術的研究，探討石竹和瞿麥無菌苗增殖和壯苗培養的最佳條件，并進一步研究不同因素對石竹和瞿麥試管苗成花的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

石竹種子和重瓣瞿麥外植體材料來自江西農業大學花卉盆景教學基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體滅菌消毒

石竹種子消毒滅菌：選取均勻飽滿的石竹種子，在自來水下沖洗浸泡30 min，之后在超凈工作臺上用濃度75 %的酒精浸泡30 s，再用濃度為0.1 %的氯化汞添加1 滴吐溫-20 滅菌8 min，無菌水沖洗4～5 次。用吸水紙吸干水分后播種在MS 培養基表面進行種子萌發。

瞿麥莖段消毒滅菌：取無花苞、腋芽未萌發的幼嫩莖段帶回實驗室，蘸洗潔精仔細刷洗枝條表面，流水下沖洗15 min。將清洗后的莖段轉入超凈工作臺，用75 %酒精消毒30 s，再用含吐溫-20 質量體積比為0.1 %的升汞溶液消毒8 min，無菌水沖洗5～6 遍，接種到誘導培養基上。

1.2.2 增殖培養

種子萌發形成的幼苗及由莖段誘導的腋芽分別接種于A2 培養基繼代1 次。當無菌長到2 cm 以上時，切取頂端2 cm 左右頂芽接種于附加不同濃度的6-BA 和NAA、的MS 基本培養基上進行增殖培養基的篩選。培養28 d 后統計其增殖系數、平均高度和玻璃化率。

1.2.3 壯苗培養

當增殖培養基上的石竹無菌苗長到2.5 m 以上時，取頂端2 cm 接種到添加不同濃度的多效唑（0 mg/L、20 mg/L、40 mg/L 和80 mg/L）及蔗糖（20 mg/L、40 g/L）組成的各培養基中進行生根壯苗培養基的篩選。培養28 d 后統計各處理無菌苗苗高、莖粗、玻璃化率并記錄其長勢。

1.2.4 開花培養

選取莖粗壯，葉片均勻，長勢較好的苗，取其頂芽，每頂芽下帶兩片葉子，接種在由不同基本培養基、植物生長調節物質濃度及配比、蔗糖和封口材料組成的開花培養基中進行花芽誘導，60 d 以后統計開花率。開花率＝開花外植體數/接種外植體總數。

1.3 培養條件

培養室溫度為25±1℃,光照2000 lx，光照時間為16 h/d。瞿麥外植體接種后先暗培養7 d，然后再置正常光照條件下培養。

1.4 數據分析

應用Excel 2003 進行數據處理，用DPS7.05 軟件進行方差分析和新復極差測驗。

2 結果分析

2.1 不同激素及濃度對石竹和瞿麥增殖的影響

結果表明：不同因素水平對石竹增殖的高度、增殖系數、玻璃化率的影響不同（見表1）。根據調整極差R’ 判斷不同因素水平對石竹苗高影響的重要性依此為：基本培養基＞封口材料＞激素種類＞空白列＞6-BA 濃度； 石竹增殖系數影響的重要性依次為：基本培養基＞封口材料＞激素種類＞BA 濃度＞空白列；不同因素水平對石竹增殖過程中玻璃化的影響依次為：6-BA 濃度＞激素種類＞空白列＞基本培養基＝封口材料。其中，基本培養MS 對苗高和增殖系數的影響優于1/2MS，塑料蓋優于封口膜，0.1 mg/L的NAA 優于等濃度的IBA，6-BA 濃度以0.5 mg/L為佳，即處理3。6-BA 濃度增大易導致石竹增殖過程中玻璃化苗的發生，激素種類對玻璃化也有一定的影響，相比較于IBA，NAA 更易導致石竹增殖培養過程中的玻璃化。而基本培養基和封口材料對石竹玻璃化影響不大。

表1 不同因素對石竹增殖影響的直觀分析表Table 1 Visual analysis table of the influence ofdifferent factors on the growth of Dianthus chinensis

方差分析結果表明（表2），基本培養基對石竹苗高的影響達到顯著水平，其它3 個因素6-BA 濃度、激素種類、封口材料對其增殖的影響均不顯著；就增殖系數而言，基本培養基和封口材料對其增殖的影響均達到極顯著水平，其它兩因素6-BA 濃度、激素種類對其增殖影響水平不顯著；就玻璃化率而言，各因素水平對石竹增殖的影響均不顯著。從表3可以看出，8 個不同處理中，苗高和增殖系數最好的都是處理3，其次是處理1、處理6 和處理7，并且與處理8 間的差異達到極顯著水平，而不同處理間玻璃化率沒有顯著差異。因此，以增殖系數為主要參考指標，在綜合評價苗高、玻璃化率的基礎上，本實驗認為石竹最佳的增殖配方為MS + 6-BA 0.5 mg/L+ NAA 0.1 mg/L，用塑料蓋封口，即處理3。增殖培養28 d，平均苗高可達到4.2 cm，增殖系數可達到2.8 倍，且無玻璃化現象發生。

表2 不同因素對石竹增殖影響結果的方差分析Table 2 Variance analysis of the effect of different factors on the proliferation of Dianthus chinensis

表3 影響石竹增殖的各個處理間差異顯著性檢驗分析表Table 3 Test and analysis table for the significance of differences between treatments affecting the growth of Dianthus chinensis

2.1.2 不同因素對瞿麥增殖影響的分析

不同因素水平對瞿麥增殖影響的重要性依次為（表4）：基本培養基＞6-BA 濃度＞激素種類＞封口材料。從各因素不同處理來看，MS 優于1/2MS 基本培養基，6-BA 濃度以0.1 mg/L 較好，苗高隨著6-BA濃度的增加呈逐漸減小趨勢，生長調節物質以NAA好于IBA，不同封口材料對瞿麥增殖過程中苗高影響不大。因此瞿麥增殖過程中苗高生長較佳培養基配方為：MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.1 mg/L 是最佳的配方，即處理1。從增殖系數來看，各因素水平對其增殖影響的重要性依次為：基本培養基＞封口材料＞6-BA濃度＞空白列＞激素種類。從各因素水平來看，MS 培養基對瞿麥的增殖效果優于1/2MS，封口材料用瓶蓋較好，6-BA 濃度以0.5 mg/L 最佳，不同植物生長調節劑種類NAA 或IBA 對瞿麥增殖影響效果差別不大，瞿麥增殖的適宜培養基配方為：MS + 6-BA 0.5 mg/L+IBA（或NAA）0.1 mg/L，封口材料用瓶蓋，即處理3。從玻璃化率來判斷，各因素水平對其影響的重要性依次為：封口材料＞基本培養基＞6-BA 濃度＞空白列＞激素種類。從各因素水平來看，瓶蓋與封口膜相比更容易導致無菌苗玻璃化，MS 基本培養基比1/2MS 中的苗玻璃化率更多，隨著6-BA 濃度增大玻璃化率也呈增加趨勢。因此，以增殖系數為主要參考指標，在綜合評價苗高、玻璃化率的基礎上，本實驗選擇瞿麥與石竹相同的增殖配方MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，用塑料蓋封口，即處理3。

表4 不同因素對瞿麥增殖影響的直觀分析表Table 4 Visual analysis table of the influence of different factors on Dianthus superbus proliferation

2.2 不同因素對石竹壯苗培養的影響

將通過增殖獲得的石竹無菌苗接種到不同壯苗培養基上，觀察苗的長勢，并在28 d 后進行統計苗高、莖粗和玻璃化率（見表5）。結果表明：隨著多效唑濃度的增加，苗的高度呈下降趨勢，但是莖的粗度沒有明顯的變化；隨著蔗糖濃度的提高，石竹節間變短，葉片有所增大，葉色變綠舒展，莖粗沒有明顯的變化。綜合評價苗的長勢和高度，認為處理7最好。各處理均沒有出現玻璃化苗。因此，本實驗認為，添加40 mg/L 的多效唑和40 g/L 的蔗糖最有利于石竹的壯苗培養。

表5 不同因素對石竹壯苗培養的影響Table 5 The influence of different factors on the cultivation of strong seedlings of Dianthus chinensis

2.3 不同因素對石竹和瞿麥試管開花誘導的影響

將獲得的無菌苗接種到不同開花誘導培養基中，60 d 后統計各不同處理開花情況（見表6）。結果表明，各處理間的石竹無一開花，瞿麥開花率僅為11.11%～16.67%，開花率極低。

表6 不同因素對石竹和瞿麥開花誘導的影響Table 6 Effects of different factors on flowering induction of Dianthus chinensis and Dianthus superbus

圖1 石竹組織培養及試管開花誘導Figure 1 Dianthus chinensis s tissue culture and in vitro flowering induction

圖2 瞿麥組織培養及試管開花誘導Figure 2 Tissue culture of Dianthus superbus and in vitro flowering induction

3 討論與小結

3.1 不同激素與濃度對石竹和瞿麥增殖培養的影響

根據實驗結果，石竹增殖的最適宜配方為MS +6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L + 瓊脂7.0 g/L +蔗糖20 g/L，用塑料蓋封口。全營養的MS 培養基不僅有利于石竹的長高，也有利于提高增殖系數。用0.1 mg/L 的NAA 效果要優于IBA。6-BA 的濃度對石竹的增殖效果不顯著，而且隨著濃度的提高會引起玻璃化苗的增加，這一結果與程云清的一致[8]。

瞿麥增殖最適宜的配方為MS + 6-BA 0.5 mg/L+ NAA 0.1 mg/L + 瓊脂7.0 g/L + 蔗糖20 g/L。透氣膜比塑料蓋的透氣性更好，有效降低在增殖培養期間的玻璃化率[9]。

3.2 多效唑和蔗糖對石竹壯苗培養的影響

實驗結果表明，一定濃度的多效唑可以使石竹苗矮化，葉色加深變綠等作用，并且隨著多效唑濃度的提高，石竹苗的高度降低。推測是由于多效唑能夠促進植物葉片碳水化合物的合成，降低氮素的積累，提升碳氮比（C/N）[10]提高蔗糖的濃度也有利于石竹苗的矮化，隨著蔗糖濃度的提高，石竹苗的高度降低。因此，40 mg/L 的多效唑和40 g/L 的蔗糖最適宜石竹的壯苗培養。但蔗糖對植物矮化作用的生理生化機制尚不清楚，還有待進一步深入研究[11]。

3.3 石竹和瞿麥試管開花影響因素

石竹和瞿麥同為石竹科石竹屬的植物，組培過程中對培養基中各成分的響應規律相似，但在本實驗中，接種在各處理培養基上的石竹均未開花，且瞿麥也僅有部分開花。推測原因一方面是石竹的外植體材料為種子，比以莖段為外植體的瞿麥更難誘導其開花；另一方面石竹科植物種子有休眠的特征[12]，在種子萌發前沒有進行催芽，瞿麥雖然開花，但是開花率低，后續可嘗試通過改變培養基中N、P、K 元素配比，或改變其他環境因素，對植物試管開花的關鍵因素及內在調控機制進行進一步深入研究[13]。