牦牛骨膠原蛋白肽體外調(diào)節(jié)腸道菌群的研究

劉春雨，衣大龍，楊玉亮，辛瑜，顧正華，劉懷高，郭自濤*，張梁*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(安徽國肽生物科技有限公司，安徽 宣城，242100)

腸道菌群是人體腸道中微生物的總稱，人體腸道內(nèi)微生物種類有1 000多種，是人體細(xì)胞的10倍左右[1]。近年來，高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)以及生物信息學(xué)分析工具的發(fā)展，促進(jìn)了對腸道菌群的研究，其中16S rRNA高通量測序以及宏基因組學(xué)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于腸道微生物多樣性研究[2]。正常情況下，腸道菌群處于動態(tài)平衡狀態(tài)，在促進(jìn)食物消化，維持腸道健康，調(diào)節(jié)免疫等方面發(fā)揮著重要作用[3]。腸道菌群失調(diào)會引起腹瀉、便秘等多種胃腸道疾病[4]。大量研究表明，腸道菌群紊亂與人體的各種慢性疾病如糖尿病、高血壓、肥胖、抑郁癥、動脈粥樣硬化[5-8]等有著密切的聯(lián)系。

近年來，使用各種益生元調(diào)節(jié)腸道菌群生長代謝的研究日益增多。然而，目前研究的益生元大多是不容易消化的低聚糖類，多肽作為益生元改善腸道菌群的潛力尚未得到充分的研究[9]。多肽是由2個至數(shù)百個氨基酸通過肽鍵連接而成的一種分子聚合物，具有特殊的生物活性[10]，多肽類物質(zhì)一直是功能性食品領(lǐng)域的研究熱點。牦牛骨是牦牛肉加工的主要副產(chǎn)品，富含蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)物質(zhì)[11]。牦牛骨中含有豐富的膠原蛋白，其酶解產(chǎn)物具有很多潛在的生物活性[12]。GAO等[13]研究表明，牦牛骨膠原蛋白肽水解物對BALB/c小鼠具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，可防止因衰老或抑制劑引起的免疫抑制反應(yīng)。目前，牦牛骨膠原蛋白肽對腸道菌群作用的研究還未見報道。

本文選用了1種酶解法制備的牦牛骨膠原蛋白肽粉，通過體外模擬胃腸消化及小鼠糞便菌群的厭氧發(fā)酵，探究牦牛骨膠原蛋白肽對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。發(fā)酵過程中檢測pH，乳酸，短鏈脂肪酸含量的變化，并利用16S rRNA高通量測序的方法分析消化后的牦牛骨膠原蛋白肽對小鼠糞便菌群組成的影響，本研究可為牦牛骨膠原蛋白肽作為功能性食品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛骨膠原蛋白肽粉，安徽國肽生物科技有限公司；胃蛋白酶、胰液，美國Sigma公司；胰蛋白胨、酵母提取物，英國OXOID公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機，美國Thermo Fisher Scientific公司；UV-3200型紫外可見分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司；EX224ZH/AD電子天平，奧豪斯儀器(常州)有限公司；Five Easy Plus pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；MLS-3750型全自動高壓蒸汽滅菌鍋，日本SANYO公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；氣相色譜儀，日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 體外模擬胃腸消化

模擬胃腸道消化參照YU等[14]的方法并稍作修改。

(1)模擬胃消化：配制30 g/L牦牛骨膠原蛋白肽溶解液。使用1 mol/L 的HCl調(diào)節(jié)溶液pH至2.0，加入適量胃蛋白酶(酶∶底物=1∶50)，37 ℃水浴搖床，100 r/min振蕩1 h，模擬胃消化。

(2)模擬腸消化：將模擬胃消化后的溶液使用1 mol/L的NaOH調(diào)pH至5.0，使胃蛋白酶失活。加入適量胰液(酶∶底物=1∶25)和牛膽鹽(牛膽鹽∶底物=1∶35)，攪拌均勻后，用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0～8.0，容器上方充氮氣，蓋緊瓶塞后放入37 ℃水浴鍋中，100 r/min振蕩反應(yīng)2 h，模擬腸道消化，最后沸水加熱10 min結(jié)束酶反應(yīng)，放入-80 ℃冷凍4 h后放入真空冷凍干燥儀中冷凍干燥[15]。

1.3.2 體外模擬發(fā)酵

(1)發(fā)酵培養(yǎng)基的配制[16]：胰蛋白胨2 g、酵母浸粉2 g、NaCl 0.1 g、K2HPO40.04 g、KH2PO40.04 g、MgSO4·7H2O 0.01 g、CaCl20.01 g、NaHCO32 g、吐溫80 2 mL、半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g、牛膽酸鹽0.5 g、氯化血紅素0.02 g、維生素K110 μL、刃天青0.001 g、乳果糖10 g、蒸餾水1 L。溶液配好后調(diào)pH 至7.0，經(jīng)高壓蒸汽滅菌(121 ℃，20 min，其中乳果糖和牦牛骨膠原蛋白肽分別單獨滅菌)后轉(zhuǎn)移到厭氧工作站除氧24 h。

(2)糞便采集：于發(fā)酵實驗當(dāng)天早上采集10周齡小鼠糞便，要求所有小鼠腸胃健康，近半年來沒有食用過抗生素。在厭氧工作站中用磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)按 1∶10(g∶mL)稀釋混勻[17]。

(3)發(fā)酵過程：向每個培養(yǎng)基中加入糞便稀釋液，接種量為1%。將消化后的牦牛骨膠原蛋白肽，分別按不同的添加劑量，設(shè)置為3種實驗組，分別為低劑量組：5 g/L；中劑量組：10 g/L；高劑量組：20 g/L。同時以不添加消化后的牦牛骨膠原蛋白肽的發(fā)酵作為空白對照組，每組做3個平行，在37 ℃厭氧條件下發(fā)酵24 h，分別在0、6、12、24 h進(jìn)行取樣，檢測發(fā)酵過程中的pH及各種含量變化。

1.3.3 發(fā)酵過程中乳酸含量的測定

采用分光光度計法測定乳酸含量。

配制10 g/L的標(biāo)準(zhǔn)乳酸溶液，并將其用超純水依次稀釋為5、2.5、1.25、0.625 g/L的質(zhì)量濃度梯度，100 μL乳酸溶液加入4 mL 0.2% FeCl3·6H2O溶液，振蕩搖勻10 s，靜置反應(yīng)15 min，在390 nm處測定吸光度，以乳酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將發(fā)酵后的樣品利用超純水分別稀釋1倍后搖勻，測定條件同上。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的乳酸含量。

1.3.4 氣相色譜測定發(fā)酵液中短鏈脂肪酸的含量

(1)氣相色譜條件[18]：色譜柱：DB-FFAP毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣：以純氮氣作為載氣，流速1 mL/min，分流比 5∶1；進(jìn)樣量：1 μL；入口溫度：200 ℃；離子焰溫度：250 ℃；升溫進(jìn)程：采用程序升溫1 min升至80 ℃，以10 ℃/min的升溫速率遞增至200 ℃。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別配制一定濃度的乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，將6種標(biāo)準(zhǔn)溶液混合均勻后，梯度稀釋，按照上述條件進(jìn)行氣相色譜檢測。以標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

乙酸回歸曲線：y=597 189x-9 049.3(R2=0.99)

丙酸回歸曲線：y=937 155x-987.31(R2=0.99)

異丁酸回歸曲線：y=1E+06x+8 326.3(R2=0.99)

正丁酸回歸曲線：y=1E+06x+9 139.4(R2=0.99)

異戊酸回歸曲線：y=1E+06x+14 201(R2=0.99)

正戊酸回歸曲線：y=1E+06x+3 498.9(R2=0.99)

(3)樣品前處理：取200 μL發(fā)酵液，加20 μL 50% H2SO4酸化10 min，再加1 mL乙醚振蕩混勻，提取脂肪酸。后于13 000×g離心15 min，取上層乙醚相，加無水Na2SO4干燥，靜置15 min，13 000×g離心5 min取上層乙醚相，色譜條件同上，檢測樣品中短鏈脂肪酸的含量[19-20]。

1.3.5 16S rRNA對發(fā)酵后糞便菌群組成的分析

1.3.5.1 DNA提取和16S rRNA測序

將待測樣品送中國華大基因股份有限公司(中國武漢)進(jìn)行DNA提取和16S rRNA基因測序。使用E.Z.N.A.細(xì)菌DNA試劑盒從糞便樣本中提取DNA[21]。設(shè)計擴增引物，以稀釋后的基因組DNA 為模板，擴增16S rRNA基因V3和V4區(qū)。文庫先由Agilent Technologies 2100 bioanalyzer進(jìn)行質(zhì)檢，然后按照Illumina的標(biāo)準(zhǔn)流程在Illumina HiSeq 2500平臺上測序，產(chǎn)生2×250 bp的配對端序列[22]。

1.3.5.2 生物信息學(xué)分析

測序結(jié)束后，序列按相似度聚類為分類單元(operational taxonomic units，OTU)相似性達(dá)到97%，每個OTU可認(rèn)為是代表1個物種[23-24]。利用Greengene數(shù)據(jù)庫將分類信息對應(yīng)到OTUs代表序列中[25]。alpha多樣性以觀測物種Chao 1、Shannon和Simpson指數(shù)表示。beta多樣性是通過主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)計算得到。根據(jù)細(xì)菌的相對豐度，統(tǒng)計分析不同組糞便微生物群在多種分類水平上組成的顯著差異。利用KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 數(shù)據(jù)庫和PICRUSt軟件預(yù)測糞便微生物菌群的功能[26]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有樣品進(jìn)行3次平行測定，采用 SPSS 25.0 軟件進(jìn)行顯著性分析。數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示顯著差異，P<0.01表示極顯著差異，并用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中pH的變化

空白組和3組實驗組在發(fā)酵過程中，各取樣時間段檢測的pH變化情況如圖1所示。與空白對照組相比，3種實驗組的發(fā)酵液pH變化速率明顯提高，在0～6 h期間發(fā)酵液pH值出現(xiàn)急劇下降。說明3種不同劑量牦牛骨膠原蛋白肽的添加，均可以調(diào)節(jié)糞便微生物的快速生長，加快底物乳果糖的消耗，使之產(chǎn)生乳酸，促使發(fā)酵液pH的快速降低。12 h后發(fā)酵液中pH變化減小，發(fā)酵逐漸停止，因此，在24 h時終止發(fā)酵過程。

圖1 發(fā)酵過程中pH的變化Fig.1 The change of pH during fermentation

2.2 發(fā)酵過程中乳酸含量的變化

分別在發(fā)酵0、6、12、24 h不同的時間段進(jìn)行取樣，檢測各組樣品的乳酸含量，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，與空白對照組相比，3組實驗組在發(fā)酵過程中乳酸含量都有顯著的提高(P<0.05)。說明消化后的牦牛骨膠原蛋白肽可以被腸道菌群很好的利用，能促進(jìn)腸道微生物的生長代謝，提高乳酸的產(chǎn)量。其中，高劑量組與空白對照組相比差異性最顯著，說明高劑量牦牛骨膠原蛋白肽的添加，對于促進(jìn)腸道菌群發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的效果較好。

圖2 發(fā)酵過程中乳酸含量Fig.2 The concentration of lactic acid during fermentation注：*表示P<0.05，**表示P<0.01(下同)

2.3 發(fā)酵液中短鏈脂肪酸含量分析

發(fā)酵24 h后，將樣品通過氣相色譜對主要的短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸、異戊酸、正戊酸)進(jìn)行分析。結(jié)果如表1所示，添加不同劑量牦牛骨膠原蛋白肽的實驗組，產(chǎn)生的短鏈脂肪酸含量顯著高于(P<0.01)空白對照組。其中，發(fā)酵24 h后高劑量組產(chǎn)生的短鏈脂肪酸的含量最高。

表1 短鏈脂肪酸含量 單位：g/L

2.4 發(fā)酵過程中腸道菌群組成的變化

2.4.1 糞便微生物多樣性分析

物種多樣性分析如圖3所示， Chao 1指數(shù)反映的是樣品中物種的豐富度,由圖3-a可知，與空白對照組相比，3組實驗組的小鼠糞便微生物物種豐度降低了。Shannon和Simpson指數(shù)反映了群落的alpha物種多樣性[27]，如圖3-b、圖3-c所示，與空白對照組相比，3種實驗組的alpha多樣性都有明顯的降低(P<0.05)，結(jié)合腸道菌群組成分析原因，可能是體外模擬發(fā)酵環(huán)境下，添加牦牛骨膠原蛋白肽對腸道菌群中特定的菌種生長產(chǎn)生了較大的促進(jìn)作用。圖3-d顯示了糞便微生物的beta多樣性，與空白對照組相比，3組實驗組間的多樣性發(fā)生了明顯的改變，上述結(jié)果表明，添加不同劑量的牦牛骨膠原蛋白肽改變了小鼠腸道菌群的多樣性。

2.4.2 糞便微生物組成分析

糞便微生物在門水平上的組成分析如圖4所示，門水平上的微生物群主要由放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)三大類組成，占總細(xì)菌的(78±5.4)%，其次是變形菌門(Proteobacteria)和疣微菌門(Verrucomicrobia)。與空白對照組相比，低濃度和中濃度實驗組放線菌門的相對豐度顯著增加(P<0.01)，說明這2種濃度的牦牛骨膠原蛋白肽能夠促進(jìn)腸道放線菌門的生長。此外，3組實驗組擬桿菌門和疣微菌門的相對豐度顯著低于空白對照組(P<0.05)，而厚壁菌門，變形菌門的相對豐度與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。

a-Chao 1指數(shù)；b-Shannon指數(shù)；c-Simpson指數(shù)；d-PCoA圖3 小鼠糞便微生物的物種多樣性Fig.3 The species diversity of mice fecal microbiota

圖4 小鼠糞便菌群在門水平上的組成Fig.4 The composition of mice fecal microbiota at the phylum level

微生物組成在科水平上進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示,小鼠的糞便微生物主要由雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)，紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)，腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)和乳桿菌科(Lactobacillaceae)組成。與空白組相比，低濃度和中濃度實驗組雙歧桿菌科的相對豐度顯著增加(P<0.01)，高濃度實驗組乳桿菌科的相對豐度顯著高于空白組(P<0.05),說明牦牛骨膠原蛋白肽對于雙歧桿菌科和乳桿菌科這2種有益菌的生長有一定的促進(jìn)作用。此外，紫單胞菌科和疣微菌科的豐度明顯低于空白對照組(P<0.05)，而紫單胞菌科和疣微菌科分別屬于擬桿菌門和疣微菌門，其在科水平上的變化趨勢與上述門水平上的相一致。

圖5 小鼠糞便菌群在科水平上的組成Fig.5 The composition of mice fecal microbiota at the family level

圖6-a是糞便微生物在屬水平上的組成情況，主要由雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)，埃希氏菌屬(Escherichia)，艾克曼菌屬(Akkermansia)，巴恩斯氏菌屬(Barnesiella)和乳酸桿菌屬(Lactobacillus)組成。其中雙歧桿菌屬的含量最高，其在不同組間的豐度變化情況如圖6-b所示，低濃度和中濃度實驗組雙歧桿菌的相對豐度顯著高于對照組(P<0.01)，而雙歧桿菌屬于雙歧桿菌科，放線菌門，其在屬水平上的變化與科和門水平上的變化一致。

2.4.3 糞便微生物功能預(yù)測

對空白組與實驗組在KEGG代謝途徑第2水平上的功能差異進(jìn)行對比分析，結(jié)果如圖7所示。圖7-a和圖7-b分別顯示了空白組與低濃度組和中濃度組的對比情況，結(jié)果顯示2組不同濃度實驗組的復(fù)制和修復(fù)功能、氨基酸代謝以及脂質(zhì)代謝都明顯高于空白組。圖7-c顯示了空白組與高濃度組的對比情況，其中膜運輸，碳水化合物代謝以及其他氨基酸代謝功能明顯高于空白組。上述結(jié)果表明，添加牦牛骨膠原蛋白肽后，小鼠腸道菌群的一些代謝功能有一定的提高。

a-小鼠糞便菌群在屬水平上的組成；b-雙歧桿菌相對豐度圖6 小鼠糞便菌群在屬水平上的組成以及雙歧桿菌相對豐度Fig.6 The composition of mice fecal microbiota at the genus level and the relative abundance of Bifidobacterium

A-空白對照組；B-低濃度組；C-中濃度組；D-高濃度組a-空白組與低濃度組；b-空白組與中濃度組；c-空白組與高濃度組圖7 小鼠糞便菌群功能預(yù)測Fig.7 The predicted functions of mice fecal microbiota

3 結(jié)論

添加不同劑量模擬消化后的牦牛骨膠原蛋白肽進(jìn)行小鼠糞便菌群厭氧發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠腸道菌群的多樣性和組成發(fā)生了明顯的變化，其中雙歧桿菌和乳酸菌這2種益生菌的含量顯著增加，說明牦牛骨膠原蛋白肽可能會促進(jìn)腸道中有益菌的增殖，具有改善腸道功能和維護(hù)腸道微生態(tài)平衡的潛力。同時，通過對小鼠糞便菌群功能預(yù)測分析可知，牦牛骨膠原蛋白肽可能會改變腸道菌群的代謝功能。牦牛骨膠原蛋白肽對于腸道菌群的調(diào)節(jié)作用需要后續(xù)進(jìn)行體內(nèi)動物實驗進(jìn)一步確認(rèn)。