克羅諾桿菌屬快速檢測體系的建立

王丹丹，李 莉，楊艷歌，劉鳴暢，王洪越，吳淑清，袁 飛,*，吳亞君,*

（1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；2.長春大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130022）

克羅諾桿菌屬（Cronobacterspp.）是一種重要的食源性病原體，其存在于土壤、水以及人和動物腸道中[1-3]。對于嬰兒，尤其是體質量低于2 500 g的早產兒[4-5]，具有很高的感染風險。克羅諾桿菌屬與新生兒腦膜炎病例、壞死性小腸結腸炎、敗血癥、血痢和腦膿腫相關[6-8]。有研究表明，克羅諾桿菌能在嬰兒奶粉中長期存活[9]，因此對克羅諾桿菌屬的及時檢出是預防其危害發生的重要手段。

傳統微生物生理生化法檢測時間長，且檢測步驟繁瑣[10-11]，因此近年來眾多研究者對微生物快檢技術進行了探索研究，目前市面上微生物快檢產品主要有即用型微生物快速檢測板[12]、顯色培養基[13-14]、ATP熒光檢測儀[15-17]、膠體金免疫層析試紙條[18-19]、進口的微生物快速檢測系統等[20-22]。但是微生物測試片、快速檢測板、顯色培養基都需要進行長時間的增菌過程[23-24]，因此檢測時間較長，無法實現微生物快速檢測。ATP熒光檢測法對檢測樣品基質要求較高，大多應用于水質檢測以及環境微生物的檢測，無法對食品等復雜基質樣品進行微生物檢測[25-26]。膠體金免疫層析試紙條其檢測限為106CFU/mL，檢測靈敏度較差[24,27]，導致其應用受到限制。目前進口的微生物快速檢測系統，雖然樣品前處理簡單，但其設備成本較高，且也需要增菌過程，故檢測時間較長。

實時聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）技術是在普通PCR基礎上添加熒光染料或熒光探針[28]，通過PCR產物的積累，使得熒光信號增加[29-30]。相比于傳統PCR技術，real-time PCR技術能實現實時對待檢成分進行定性、定量分析，無需進行電泳，節省了檢測時間[31-32]，目前被廣泛用于微生物的檢測研究。本研究建立集克羅諾桿菌屬一步法DNA提取和快速real-time PCR方法為一體的速測技術，通過方法優化，整個檢測流程可在40 min內完成。同時對建立的一步法DNA提取技術與傳統煮沸法進行比較，顯示檢測靈敏度幾乎與傳統的煮沸法等同，該方法在不前增菌情況下對克羅諾桿菌的檢測靈敏度可達104CFU/mL，在短時間（8 h）前增菌的情況下靈敏度可達10 CFU/mL，大大縮短了檢測時間，以期為口岸食源性病源微生物現場快速檢測提供良好的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嬰幼兒配方奶粉1段購自北京某超市。丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌（DSM18702） 德國菌種細胞保藏中心；阪崎腸桿菌（ATCC29544） 美國菌種保藏中心；均貯存于中國檢驗檢疫科學研究院菌種庫。

胰蛋白胨大豆湯（tryptone soya broth，TSB）培養基、胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya ager，TSA）培養基英國Oxoid公司；PrepManTMUltra Sample preparation Reagent試劑盒 美國Thermo Fisher公司；DNA提取試劑盒 英國MicroGEM公司；2×TaqMan Fast qPCR Master MIX (Low Rox) BBI Life Sciences公司；QuantiNova Probe PCR Kit（100） 德國QIAGEN公司；Luna Universal Probe qPCR Master Mix美國BioLabs公司；GoldstarTaqMan Miture (Low Rox)和HyperProbe Mixture 北京康為世紀生物科技有限公司；TaqMan Fast Advanced Master Mix、TaqManTMGene Expression Master Mix 美國Applied Biosystems公司；SsoAdvanced Universal Probes Supermix 美國Bio-Rad Laboratories公司。

1.2 儀器與設備

D2012 plus高速可調離心機、NANODROP 2000C紫外分光光度儀 美國Thermo Fisher公司；渦旋混合器 德國IKA公司；拍擊式均質器 法國Interscience公司；高壓滅菌鍋 以色列Tuttnauer公司；DH-420電熱恒溫培養箱 美國Memmert公司；水浴鍋金壇市白塔新寶儀器廠；DNA PDQex核酸提取儀英國MicroGEM公司；迷你實時熒光PCR儀 杭州安塔生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養

將克羅諾桿菌屬進行活化，接種于TSB培養基中，37 ℃培養過夜[33]，然后將活化的菌落進行保存，TSB液體培養基培養的菌液使用60%的甘油-20 ℃保存備用[34]。

1.3.2 DNA提取

1.3.2.1 煮沸法

采用SN/T 1632.3—2013《出口奶粉中阪崎腸桿菌（克羅諾桿菌屬）檢驗方法》第3部分：熒光PCR方法[35]，對奶粉中克羅諾桿菌屬的DNA進行提取。取待測樣本增菌液1 mL置于1.5 mL離心管離心，再加入100 μL PrepMan Ultra提取液于離心管中，渦旋振蕩混勻30 s左右，然后100 ℃水浴10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液即為DNA模板，測其濃度后于-20 ℃保存[36]。

1.3.2.2 快提法

移取20 μL的對數期菌液到1.5 mL的離心管中，加入98 μL（ddH2O、10 μL 10×Green buffer、2 μL PrepGEM）的提取混合液混勻，將提取混合液和樣本加入PDQeX試管中，在MicroGEM DNA PDQex核酸提取儀上按照操作程序：75 ℃ 10 min、95 ℃ 2 min進行溫控反應，即可直接獲取DNA。

1.3.3 real-time PCR

根據SN/T 1632.3—2013第3部分：熒光PCR方法[35]合成引物探針，正向引物序列為5’-GGCGAGCGGCGAATATTAT-3’，反向引物序列為5’-CGGGTTTTCCCAGTTGAGATC-3’，探針序列為5’-FAM-CACCAGTTTTCGGTGCGCCAGC-BHQ-3’。real-time PCR體系：總體積25 μL包含12.5 μL real-time PCR預混液；10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，10 μmol/L探針0.5 μL，模板DNA 5 μL，無菌ddH2O 6 μL。

1.3.4 快速real-time PCR程序優化

為建立快速real-time PCR程序，傳統real-time PCR程序（50 ℃、2 min，95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，55 ℃、1 min，40 個循環），在循環數不變的情況下，對各階段的反應時間進行優化，優化情況見表1。每個樣品平行檢測2 次，并進行2 次重復實驗。

表1 快速real-time PCR程序Table 1 Fast real-time PCR reaction program

1.3.5 快速real-time PCR體系優化

1.3.5.1 預混液的選取

分別選1～8號酶：2×TaqMan Fast qPCR Master MIX(Low Rox)、QuantiNova Probe PCR Kit、Luna Universal Probe qPCR Master Mix、HyperProbe Mixture、GoldstarTaqMan Miture(Low Rox)、TaqMan Fast Advanced Master Mix、TaqManTMGene Expression Master Mix、SsoAdvanced Universal Probes Supermix，進行real-time PCR擴增，比較其擴增效率。每個反應平行檢測2 次，并進行2 次重復實驗。

1.3.5.2 預混液用量的優化

目前快速real-time PCR預混液的用量為12.5 μL，考慮到實驗成本，對預混液用量進行優化。預混液的用量依次為12.5、10、8、7、6、5 μL，保持反應體系25 μL不變，預混液減少部分用ddH2O代替，進行快速real-time PCR擴增，選擇最適預混液的用量。每個反應平行檢測2 次，并進行2 次重復實驗。

1.3.5.3 探針用量的優化

目前快速real-time PCR體系探針的用量為0.5 μL，考慮到實驗成本，對探針用量進行優化。使體系探針用量依次為0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 μL，保持反應體系25 μL不變，酶減少部分用ddH2O代替，進行快速real-time PCR擴增，選擇最適探針用量。每個反應平行檢測2 次，并進行2 次重復實驗。

1.3.6 純菌液檢出限的確定

接種克羅諾桿菌屬于TSB培養基中，37 ℃過夜培養。使用平板菌落計數法計數，10 倍梯度稀釋菌液。分別用煮沸法和快提法提取基因組DNA，并進行快速realtime PCR擴增。用ddH2O作空白對照，每個反應平行檢測2 次，并進行2 次重復實驗。

1.3.7 人工污染奶粉檢出限確定

在超凈工作臺中稱取25 g新開封的某品牌嬰幼兒配方奶粉1段于225 mL生理鹽水中，充分振蕩混勻配制成質量分數10%的均質液，即每1 g奶粉樣品相當于10 mL均質液。分別接種丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌和阪崎腸桿菌于TSB培養基中，37 ℃培養8 h。使用平板計數法統計菌體濃度，取1 mL菌液用滅菌生理鹽水進行10 倍梯度稀釋，然后對勻漿液分別人工污染不同濃度的克羅諾桿菌屬菌液，制成人工污染樣品。取人工污染克羅諾桿菌屬的奶粉樣品提取模板DNA，進行快速real-time PCR檢測，確定檢出限。用ddH2O作空白對照，每個反應平行檢測2 次，并進行2 次重復實驗。

1.3.8 檢測結果的判定

參考SN/T 1632.3—2013第3部分：熒光PCR方法[35]判斷其檢測結果。

1.4 數據統計及圖表繪制

從儀器導出2 次重復實驗的檢測結果和數據，并錄入在Excel表格中，在Excel中用“AVERAGE”計算平均值，選中“STDEV”計算標準偏差。根據數據繪制三線表、柱形圖或散點圖。為清晰展示結果，部分增加趨勢線，柱形圖用不同顏色和圖案填充；以重復實驗的標準偏差添加誤差線，部分用多個圖組合進行結果呈現。

2 結果與分析

2.1 快速real-time PCR程序的建立

以丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌和阪崎腸桿菌DNA為模板，對反應程序進行優化，結果如圖1所示。檢測時間從傳統的82 min左右縮短至27 min 15 s，縮短了1 h左右。real-time PCR擴增效率顯示，阪崎腸桿菌檢測的Ct值僅從開始的17.34增加到18.29，丙二酸鹽陽性克羅諾檢測Ct值從開始的16.35反而降低到14.82。2 種菌的擴增變化均在1 個循環左右，表明建立的快速real-time PCR程序對檢測結果影響不大。

圖1 快速real-time PCR擴增程序的優化Fig. 1 Optimization of the fast real-time PCR amplification procedure

2.2 快速real-time PCR體系的優化

2.2.1 預混液的優化

為了篩選適用于快速real-time PCR檢測程序的預混液，選取市面上常見品牌的8 種酶，以丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌和阪崎腸桿菌DNA為模板，采用上述建立的快速real-time PCR程序對8 種酶的擴增效率進行分析，擴增結果分別如圖2A、B所示。并對實驗結果進行數據分析（圖2C），結果顯示，6號酶對丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌的擴增結果最好。而對于阪崎腸桿菌，1號酶和6號酶對阪崎腸桿菌的擴增效果均較好，平均Ct值分別為17.77±0.81和18.06±0.91，結果相差不大。綜合2 種菌的檢測結果，選定6號酶即TaqMan Fast Advanced Master Mix作為快速real-time PCR檢測的預混液。

圖28 種real-time PCR預混液擴增結果分析Fig. 2 Analysis of amplification results with eight real-time PCR premixes

2.2.2 反應體系優化

影響real-time PCR檢測費用的2 個主要因素是realtime PCR預混液和探針，因此為降低實驗成本，對其進行體系優化。首先對預混液用量進行優化，結果（圖3A）顯示預混液用量為7 μL時與標準體系的擴增結果相差不大，而當預混液用量為6 μL時擴增效率顯著降低。因此在保證檢測結果的前提下，為降低實驗成本，推薦預混液的用量為7 μL。

進一步對探針的用量進行優化，結果如圖3B所示，探針用量從0.5 μL降到0.2 μL時擴增結果影響不大，因此推薦探針用量為0.2 μL。

圖3 反應體系優化結果Fig. 3 Optimal conditions of the reaction system

2.3 快提法與傳統煮沸法結果比較

為了快速高效地獲取克羅諾桿菌的DNA，本研究通過比較后采用MicroGEM DNA提取試劑盒提取克羅諾桿菌的DNA，該方法可在直接挑取菌落或取菌液后僅通過溫控反應一步法獲取DNA。為了分析其檢測效率，將快提法與傳統煮沸法進行比較。通過平板菌落計數法計數測定丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌、阪崎腸桿菌原菌液初始濃度均為108CFU/mL，進行10 倍梯度稀釋后，其濃度分別為107、106、105、104、103、102、101、100CFU/mL，分別通過快提法和煮沸法提取2 種菌的DNA，并用快速real-time PCR進行檢測，對實驗結果進行分析，分別如圖4和圖5所示。

圖4 丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌檢測結果Fig. 4 Results of Cronobacter malonaticus detection

圖5 阪崎腸桿菌檢測結果Fig. 5 Results of Enterobacter sakazakii detection

結果（圖4）顯示，快提法和煮沸法對丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌純菌的檢測靈敏度均為104CFU/mL，人工污染樣品培養1、2、3 h的靈敏度為104CFU/mL，培養4 h的靈敏度為103CFU/mL，培養5、6 h的靈敏度都為102CFU/mL，培養7 h快提法的靈敏度為102CFU/mL，煮沸法的靈敏度為101CFU/mL，培養8 h快提法的靈敏度為101CFU/mL，比煮沸法靈敏度低1 個數量級。

阪崎腸桿菌快提法和煮沸法檢測結果（圖5）顯示，快提法和煮沸法對純菌的檢測靈敏度都為104CFU/mL，快提法對人工污染樣品培養前5 h的靈敏度為104CFU/mL，煮沸法在培養0 h時檢測靈敏度為105CFU/mL，培養到5 h之前靈敏度為104CFU/mL，培養6 h的靈敏度均為103CFU/mL，培養7 h靈敏度均為102CFU/mL，培養8 h快提法的靈敏度為101CFU/mL，而僅比取樣量超出50 倍的煮沸法的靈敏度低1 個數量級。以上檢驗結果表明建立的一步法DNA提取技術檢測的靈敏度幾乎與傳統的煮沸法等同，可以滿足現場檢測快速便捷的檢測需求。

3 討論與結論

丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌和阪崎腸桿菌的快提法與傳統煮沸法檢驗結果表明，2 種方法對純菌的檢測以及人工污染樣品培養前6 h可以達到同樣的靈敏度，到7、8 h時，快提法的檢出限較傳統煮沸法低1 個數量級，分析可能是2 種方法取樣量差異造成的，煮沸法取樣量是快提法取樣量的50 倍，導致2 種方法在檢測結果上稍有偏差。雖然煮沸法靈敏度稍高于快提法，但是傳統煮沸法需要離心、煮沸、再離心、去脂肪及蛋白質等步驟，整個過程需要30 min左右。而本研究建立的一步法快速提取DNA是通過使用降解能力遠高于蛋白酶K的嗜熱蛋白酶，提取流程僅通過取樣-加液-溫控反應即可完成DNA提取。這樣避免了傳統煮沸法的離心、沸水浴等過程，也避免了傳統磁珠法/吸附柱法中吸附、洗脫、洗滌等環節反復移液操作造成的損失，在快速提取的同時保證了DNA的高收率。可在12 min左右獲取目標菌株DNA，極大簡化了提取步驟，提高了DNA提取效率。

目前微生物快檢技術主要研究方向包括分子生物學技術、傳感器技術以及光譜技術。其中分子生物學技術除了本實驗涉及的real-time PCR技術外，應用較多的還有環介導等溫擴增技術，該技術在未增菌的情況下，其對微生物的檢出限達到103CFU/mL[37]。該技術雖然較realtime PCR技術對儀器的要求更低，但該技術需引入多條引物，對引物要求較高[36]。傳感器技術主要包括光學生物傳感器、電化學生物傳感器以及機械生物傳感器，對微生物的檢出限也可達到103CFU/mL[36,38-40]。該技術檢測微生物具有快速、靈敏、操作簡單、對操作人員要求低等特點，但食物基質的復雜性限制了生物傳感器的靈敏度和特異性，生物傳感器用于識別生物分子的原件其壽命相對較短，且生產成本也比較高，所以生物傳感器技術的使用受到了一定的限制，大多還處于研制階段[41-42]。拉曼光譜及表面增強拉曼光譜技術是目前應用較多的檢測微生物的光譜技術，拉曼光譜技術對微生物的檢出限為103CFU/mL[43]，而表面增強拉曼光譜的檢出限可達100CFU/mL[44]。該技術檢測微生物具有預處理步驟簡單、對菌體無損傷等優點，但其圖像易受生長環境、生長狀態以及標本制作過程等因素的影響，且其檢測的波長，樣品處理方式都不統一，因此還需要不斷發展以更好的應用在微生物檢測領域[45]。本實驗建立的快速檢測技術基于基因進行檢測，受食物基質影響較小，且操作步驟快速簡單、靈敏度高，結果也不需要進行電泳等步驟，具有很好的應用前景。

通過調查，發現市面上微生物的快速檢測設備較少，且基本都需要長時間的前增菌培養，例如，目前應用較多的微生物快速檢測系統檢測10 CFU/mL的菌至少需要培養16 h[20-22]，而本研究建立的速測技術，僅培養8 h即可達到上述檢出限，且從DNA提取到快速real-time PCR檢測僅需40 min即可完成。同時該方法在不前增菌的情況下對克羅諾桿菌屬檢測的靈敏度可達104CFU/mL，而微生物快速檢測系統要達到相同檢測靈敏度，至少需要培養8 h，因此本研究建立的速測技術具有明顯的優勢。然而目前該方法也存在一些技術問題，主要是由于DNA提取管的容量小（100 μL）導致取樣量太少，影響了檢測的靈敏度。后期將通過加大提取管的容量，或使用濾膜、免疫磁珠等方式富集菌體提高取樣量，從而提高檢測的靈敏度。另外本實驗所用迷你real-time PCR儀升降溫速率快，可達10 ℃/s，使整個變溫擴增過程所需要的時間大大減少；僅A4紙大小，方便攜帶；且具有固定、無運動的光學部件，長期使用或移動運輸無需高昂繁瑣的定期校準維護。因此本研究后期將通過組合一步法快速提取DNA技術配套迷你real-time PCR儀，形成一個便攜式微生物快速檢測集裝箱，為小空間、口岸、現場快速檢測等場景的應用提供良好的技術支撐。