結核分枝桿菌Hrp1蛋白的生物信息學分析

劉 靜，吳 芳，張 杰，董江濤，柳小玲，梁 粟，王 菊，張春軍，吳江東，章 樂，趙海軍，張萬江

全世界約有1/3的人口感染了結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)，其中大多數是潛伏性感染(Latent Tuberculosis Infection，LTBI)，目前無有效治療LTBI患者的疫苗和藥物，早發現結核桿菌潛伏感染患者，并對其進行診斷治療，可以控制后期結核病患者人數[1]。Rv2626c基因的表達是MTB處于休眠期的重要標志之一，Rv2626c抗原受控于休眠調節子DosR(dormancy regulon)，編碼缺氧反應蛋白1(hypoxic response protein 1, Hrp1)，Hrp1蛋白具有較好的抗原性和免疫原性，能有效刺激機體產生一定的細胞免疫及較高的抗體水平，并且該蛋白易被LTBI患者所識別[2]，多項研究提示其很有可能會成為一種新型診斷MTB潛伏感染的候選抗原和治療潛伏性感染的候選疫苗。為此，本文對Hrp1蛋白進行生物信息學研究分析，對其結構功能進行全面分析預測，為進一步了解MTB長期潛伏感染機制提供理論依據，以期為篩選 MTB 診斷標志物和研制新型結核疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

通過NCBI網站查詢，Hrp1蛋白由143個氨基酸序列組成，檢索的氨基酸序列如下：MTTARDIMNAGVTCVGEHETLTAAAQYMREH-DIGALPICGDDDRLHGMLTDRDIVIKGLAAG-LDPNTATAGELARDSIYYVDANASIQEMLN-VMEEHQVRRVPVISEHRLVGIVTEADIARH-LPEHAIVQFVKAICSPMALAS。

1.2 方 法

1.2.1 Rv2626c基因開放閱讀框架分析及其編碼蛋白的理化性質及親疏水性分析 分析Rv2626c基因的開放閱讀框架，采用NCBI網站中的ORF Finder軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)。上傳Rv2626c基因編碼的氨基酸序列至Protpapram生信軟件(https://web.expasy.org/protparam)及ProtScale生信軟件(http://web.expasy.org/protscale)，分析其編碼蛋白Hrp1蛋白的理化性質，包括氨基酸數目、分子式、分子質量、氨基酸組成、等電點、親(疏)水性等。

1.2.2 Hrp1蛋白的信號肽、跨膜區、糖基化及磷酸化位點預測 運用信號肽分析系統SOSUI(http://harrier.nagahama-i-bio.ac.jp/sosui/)在線軟件及Signal IP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析Hrp1的信號肽及其位置；運用跨膜區預測軟件Tmpred(https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED-form.ht)分析Hrp1蛋白跨膜區；TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)軟件輸入Hrp1蛋白的氨基酸序列，對該蛋白的拓撲結構進行預測分析[3]。利用分析Hrp1的糖基化位點采用NetNGlyc軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)；預測Hrp1蛋白的磷酸化位點采用NetPhos 3.1 Server磷酸化分析軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)。

1.2.3 Hrp1蛋白的亞細胞定位分析 聯合運用3種在線軟件：PSORT(https://www.genscript.com/psort.html)、WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)和TargetP-2.0-CBS(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)對Hrp1蛋白進行亞細胞定位分析；預測Hrp1蛋白的核定位信號，運用NLStradamus在線軟件(http://www.moseslab.csb.utoronto.ca/NLStradamus/)。

1.2.4 Hrp1蛋白結構預測 運用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)預測 Hrp1蛋白的二級結構；SWISS-MODEL在線軟件(https://swissmodel.expasy.org)對 Hrp1蛋白進行三級結構同源性建模分析。

1.2.5 Hrp1蛋白與人類蛋白的同源性分析 采用EXPASY進入主頁(https://web.expasy.org/blast/)，將Hrp1蛋白的氨基酸序列輸入后，點擊Homo sapiens，確定Run BLAST后，可對Hrp1蛋白氨基酸序列與人類蛋白的同源性進行BLAST分析。

隨著時代發展，無人艇技術已得到深入發展。無人艇不僅可用于民用領域，比如海上搜救、垃圾清理和環境監測等方面，還可用于軍事上的海上巡邏、偵查、監視和掃雷等方面，具有十分廣泛的應用領域。[1]同時，無人艇路徑規劃對于艦船實現自動化航行和航線優化具有重要意義，要求在復雜的海洋環境中，根據已知的地理信息數據，尋找出一條從起點到終點的最安全且航程最短的航線。[2]目前已有多種算法被應用于路徑規劃，例如粒子群算法[3]、神經網絡算法[4]和人工勢場法。[5]其中遺傳算法較為靈活，使用相對廣泛，已被應用于眾多無人設備的路徑規劃。

1.2.6 Hrp1蛋白的B細胞表位、輔助性T細胞表位、細胞毒性T淋巴細胞表位預測 在IEDB(http://www.iedb.org/home-v3.php)網站，輸入氨基酸序列，通過Karplus&Schulz分析柔韌性、Kolaskar&Tongaonkar預測抗原性、Emini預測抗原表面可及性、Parker 預測親水性及Chou&Fasman 法預測氨基酸編碼蛋白質的β轉角，對B細胞表位進行聯合預測分析；β轉角與無規則卷曲多出現在蛋白表面，為凸出疏松結構，與抗體更有利結合，成為B細胞抗原表位可能性較大[4]；最后選取親水性與表面可及性良好、柔韌性強、抗原性好、最好為卷曲和轉角這種可能性大的區域作為候選B細胞表位，盡量避開α螺旋、β折疊結構。通過SYFPEITHI在線生信軟件(http://www.syfpeithi.de/0-Home.htm)對Hrp1抗原蛋白Th表位進行預測[5]，進入SYFPEITHI首頁，選擇HLA-DRB1*0101、0401、0701、0801、1101、1501這6種HLA基因分型進行預測輔助T細胞表位，選取得分為22分以上的氨基酸序列，綜合分析后篩選出候選的輔助T細胞表位。利用RANKPEP在線生信軟件進行預測，進入預測界面(http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html)，將Hrp1氨基酸序列輸入，選擇SYFPEITHI所預測的HLA基因分型，找出在線軟件紅色標記的結果，篩選出結果較好的多肽序列作為候選的細胞毒性T淋巴細胞表位。最后采用DNAStar軟件中Protean模板得到關于Hrp1蛋白表位預測的位置圖，該圖可直觀看到Hrp1蛋白表位富集的區域，具體在圖中表現為紅色方塊標記的區域。

1.2.7 Hrp1蛋白的相互作用蛋白預測及富集分析 將Hrp1全長氨基酸序列上傳至STRING在線軟件(http://string-db.org/cgi/input.pl)，對Hrp1的相互作用蛋白進行預測，其生物過程進行功能富集分析。

2 結 果

2.1 Rv2626c基因開放閱讀框架分析及其編碼蛋白的理化性質及親疏水性分析結果

2.1.1 Rv2626c基因開放閱讀框架分析 結果顯示Rv2626c基因(ID：888576)位于MTB(H37Rv)的全基因組(NC-000962.3)的2952562-2952993區域，全長432 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG，Rv2626c基因含有5個開放閱讀框，其中最長的一個開放閱讀框顯示Rv2626c基因基本被通讀，全長432 bp，與預測的編碼Hrp1蛋白長度基本相似。

2.1.2 Rv2626c基因編碼蛋白質的理化性質及親疏水性分析 根據Protpapram預測結果，該蛋白的理論等電點PI為4.96，分子量為15 517.72；該蛋白由143個氨基酸構成，包含19種氨基酸，其中以丙氨酸(A)(13.3%)、異亮氨酸(I)(8.4%)、纈氨酸(V)(8.4%)3種氨基酸的組成比例較高，不包括色氨酸(W)、吡咯賴氨酸(O)和硒半胱氨酸(U)。帶負電荷的殘基(Asp+Glu)總數為21,帶正電荷的殘基(Arg+Lys)總數為11。Hrp1蛋白分子式為C667H1084N194O211S10，原子總數2 166，Rv2626c基因編碼蛋白的消光系數為4 595，280 nm處的吸光度為0.296。當蛋白的N端殘基為Met時，該蛋白在哺乳動物網狀細胞中的半衰期為30 h，在酵母體內的半衰期大于20 h，在大腸桿菌體內的半衰期大于10 h。Hrp1蛋白不穩定性指數為19.62，為穩定蛋白，脂肪族氨基酸指數為100.35，平均親水為0.042。ProtScale預測進一步分析顯示Rv2626c基因編碼蛋白為親水性蛋白，第99位氨基酸親水性得分最高為-1.767；第132為氨基酸疏水性得分最高為1.9(圖1)。

Note：Abscissa for the amino acid position, the vertical axis for the hydrophobic score(pro，hydrophobic，respectively，with negative values，positive values)

2.2 Hrp1蛋白的信號肽、跨膜區、糖基化及磷酸化位點分析 運用信號肽分析系統SOSUI結果顯示該蛋白為可溶性蛋白，無信號肽，該蛋白是具有一個跨膜區長度為23個氨基酸序列的跨膜螺旋，N端氨基酸位于第1位，C端位于第16位，跨膜區氨基酸序列為 MTTARDIMNAGVTCVG；Signal IP結果顯示該蛋白max.C值為0.131，max.Y值為0.117，max.S值為0.143，mean S值為0.107，其中mean S值若大于0.5，則預測為分泌蛋白，存在信號肽；故可知該蛋白沒有信號肽，不是分泌蛋白而是膜蛋白。TMpred分析Hrp1蛋白在17-33、127-143氨基酸之間可能存在跨膜結構，無信號肽(圖2)。

圖2 Hrp1蛋白跨膜結構預測(左)與信號肽預測(右)

TMHMM提交蛋白序列的全部氨基酸殘基共143個，結果預測分析得到該蛋白(圖3)跨膜螺旋氨基酸數為0.007 25(該指標>18提示很有可能為跨膜蛋白)，N端前60個氨基酸中跨膜氨基酸數為0.003 25，N端位于膜胞質側的總概率為0.469 45。綜合分析表明Hrp1蛋白位于膜外，為非跨膜蛋白。

The axis of represents the amino acid residue number(1-210)corresponding to the submitted protein sequence.The vertical axis values are the probabilities that each amino acid is inside the membrane, outside the membrane, and the helix region.

在線軟件NetNGlyc分析Hrp1的糖基化位點存在于84位(圖4)；采用NetPhos 3.1 Servera在線軟件預測Hrp1蛋白有6個磷酸化位點，其中磷酸化絲氨酸位點有2個，分別位于77、106位氨基酸；磷酸化蘇氨酸位點有2個，分別位于3、50位氨基酸；2個磷酸化酪氨酸位點，分別位于79、80位氨基酸(圖5)。

圖4 Hrp1蛋白亞基糖基化位點分析

圖5 Hrp1蛋白磷酸化位點分析

2.3 Hrp1蛋白的亞細胞定位分析 PSORT結果顯示該蛋白其亞細胞定位于細胞質，可靠性為94.1%；在線軟件WoLF PSORT分析結果得出Cysk為12, cyto為9.5, mito為4, nucl為1.5，cyto-nucl為6，表明Hrp1蛋白可能定位于細胞質；TargetP-2.0-CBS結果顯示該蛋白屬于分泌蛋白的可能性為0.000 1，定位在其他位置的可能性為0.999 7；NLStradamus在線軟件預測Hrp1蛋白無NLS，可推測此蛋白位于細胞核外。綜合4種在線軟件分析可得Hrp1蛋白亞細胞定位于細胞質。

2.4 Hrp1蛋白結構預測分析 利用在線分析軟件SOPMA預測Hrp1蛋白的二級結構，α-螺旋(Hh)63個，占44.06%；β-轉角(Tt)11個，占7.69%；β-折疊(Ee)30個，占20.98%；無規則卷曲(Cc)39個，占27.27%(圖6)。該蛋白結構較穩定。

Blue red green and purple stand for alpha helix extended strand beta turn and random coil respectively

利用SWISS-MODEL軟件，對Hrp1蛋白的三級結構進行預測分析，選擇同源性最高的1xkf.1為模板，基于Hrp1蛋白的X射線分析進行同源三級建模(圖7)。其GMQE評分為0.91，QMEAN評分為1.47，手勢向上，說明該模型結果可靠，質量較好。

圖7 Hrp1蛋白三級結構的預測

2.5 同源性分析結果 BLAST結果得出，Hrp1中氨基酸序列在第11-70位，與人類蛋白質鋅指蛋白440(ZNF440)的96-153位氨基酸相似性較高，但二者的相似度僅為25%，因此，Hrp1與人類蛋白相比，同源性較低，交叉反應發生的概率較低，可以作為候選的新型結核疫苗和結核病診斷靶點，該抗原蛋白的表位可以進行生信分析，對結核病診斷與候選表位疫苗有一定的參考研究價值。在研究分析中，即在預測和篩選表位時，應注意避免選擇位于11-70的氨基酸序列，以降低交叉反應的概率[6]。

2.6 Hrp1蛋白的B細胞表位、輔助性T細胞表位、細胞毒性T淋巴細胞表位預測

2.6.1 Hrp1抗原蛋白的B細胞表位預測 通過IEDB軟件對Hrp1蛋白的B細胞表位進行預測，結果顯示Hrp1蛋白的可塑性、表面可及性、線性表位、β-轉角、親疏水性、抗原6個方面(圖8)，柔韌性越強越有利與抗體結合，柔韌性參數以基線1.0為參照，高于1.0的氨基酸區段柔韌性強，是易形成抗原表位的區域，可及性高于基線1.0的區段易形成B細胞表位，再通過結合線性表位、β-轉角、抗原性這3個方面篩選，篩選得出B細胞表位(表1)。

Note: A：Linear Epitope Prediction 2.0 Results; B：Beta-Turn Prediction Result; C：Fexibility Prediction Results; D：Surface Accessibility Prediction Results; E：Hydrophlicity Prediction; F：Antigenicity Results

表1 Hrp1蛋白B細胞抗原表位預測結果

2.6.2 預測Hrp1蛋白的輔助性T細胞表位結果 使用輔助性T細胞表位分析軟件預測Hrp1蛋白的限制性Th細胞表位，對候選意義的每一種HLA 亞型相應的表位數目情況進行統計，其中HLA-DRB1 * 0401、HLA-DRB1*0701表型的表位數量最多，結果如表2所示；對于某個表型預測分值較高的氨基酸序列進行下一步分析選擇，以作為候選Th表位，如表3為最終結果。

表2 SYFPEITHI軟件預測的Hrp1蛋白Th細胞表位信息

表3 Hrp1蛋白Th細胞表位綜合分析

2.6.3 Hrp1蛋白的細胞毒性T淋巴細胞預測分析結果 根據預測軟件結果，選擇出每一種表型分值較高的多肽序列，其可成為候選CTL表位，具體結果見表4。

表4 Hrp1蛋白CTL表位綜合分析

結合Hrp1蛋白的B細胞表位、輔助性T細胞表位、細胞毒性T淋巴細胞表位預測結果，根據DNAStar軟件中Protean模板得到關于Hrp1蛋白表位預測的位置圖，該圖可直觀看到Hrp1蛋白表位富集的區域，具體的表位富集表現在紅色方塊標記的區域(圖9)。

圖9 Hrp1蛋白表位預測位置圖

2.7 Hrp1蛋白的相互作用網絡預測結果 STRING在線分析軟件預測了與Hrp1蛋白相互作用的蛋白有Rv2627c、Rv2628、Rv1738、devR、Rv2624c、TB31.7、rip3、pfkB、guaA、hspX(圖10)。通過分析Hrp1的相互作用蛋白，可得Hrp1可能在活化的巨噬細胞內產生大量 NO，然后作為細胞間的信號分子殺傷被吞噬的微生物，調節體內細胞一系列重要的功能；該蛋白可能與抑制蛋白質合成有關，刺激巨噬細胞和外周血單個核細胞分泌重要的細胞因子，然后減少細菌生長，該蛋白的相互作用網絡主要涉及NF-kB信號通路。

圖10 MTB H37Rv Hrp1相互作用蛋白

3 討 論

目前在臨床上唯一預防結核病的疫苗是卡介苗(BCG)，但卡介苗基因組發生的眾多突變導致相當一部分人群喪失保護效力，其對不同人群的保護效率差異較大，機體保護水平范圍從0%～80%不等，且對潛伏感染MTB沒有保護效果[7]。在臨床上約有90%的結核桿菌感染者，其身體基本上處于健康狀態，但是如果機體免疫系統缺乏抵抗力，結核桿菌會重新復制，病灶被打破，隨之大量的細菌釋放，首先進入肺部，隨后至全身，發展為活動性肺結核，故結核病疫情控制工作者一直關注結核潛伏期感染診斷試劑和治療性疫苗的研究開發。結核桿菌可以在細胞內潛伏數十年，因此需要一個可以誘導具有長期記憶的綜合免疫保護應答疫苗，在持續感染人群中,檢測到對持續感染期抗原的具有一定的特異性反應，而沒有在卡介苗免疫人群檢測到，因此猜想以潛伏感染相關蛋白設計相關疫苗，有希望研究出針對持續感染期抗原的保護性免疫反應，這有助于在潛伏感染期間清除MTB的復發。對結核分枝桿菌相關潛伏感染蛋白以生信軟件為基礎進行結構功能的生物信息學分析，可為結核病潛伏感染致病機制的闡述及新型藥物結核疫苗的開發提供一定的研究理論基礎，而關于抗原表位的研究也成為最近MTB診斷預防治療的重點方向。在本文研究中，聯合運用生物信息學的技術方法對Hrp1蛋白的相關信息進行分析、處理、模擬和預測，本文預測抗原表位的模式，可提高該蛋白用于表位疫苗的研發及診斷和實驗試劑開發的水平，避免耗費大量的人力和物力，對免疫學的發展非常有益，使免疫學數據更加豐富。

缺氧反應蛋白1是由Rv2626c基因編碼，Bashir等在研究中發現實驗鼠的巨噬細胞表面結合重組Hrp1蛋白后可以引起小鼠體內發生Ⅰ型免疫反應，并且小鼠體內的NO及iNOS分泌量增加，小鼠巨噬細胞B7-1、B7-2和CD40的表達隨之增強，經重組Hrp1蛋白刺激后的小鼠巨噬細胞和活動性結核病患者的外周血單個核細胞可分泌高水平的IL-12及TNF-α[8]。Azzurri等應用ELISA方法對結核病患者血清中抗Hrp1抗體水平進行檢測，結果發現未經治療的活動性結核病患者高于結核病密切接觸者及健康社區對照人群，結核病患者化療后抗Hrp1抗體水平下降[9]。Roupie等將Hrp1 DNA疫苗免疫小鼠，發現小鼠IFN-γ和IL-2分泌增加，Hrp1 DNA疫苗可以誘導較強的體液免疫反應及Th1型細胞免疫反應的效力優于其他潛伏感染抗原Rv1733c、Rv1738、Rv2029c、Rv2031c、Rv2023、Rv2627c及Rv2628[10]。由此可知Hrp1具有較好的免疫原性，其通過固有免疫及獲得性免疫兩種方式來調節巨噬細胞的效應能力，且該抗原蛋白很容易被結核分枝桿菌潛伏患者所識別，多項研究提示其很有可能會成為一種新型診斷MTB潛伏感染的候選抗原和潛伏性感染的候選疫苗。

本研究利用多種工具和生物信息學資源對結核分枝桿菌Hrp1蛋白的性質、結構、功能等進行分析。結核分枝桿菌Hrp1由143個氨基酸組成，該蛋白分子式為C667 H 1084 N194 O211 S10，理論等電點PI為4.96，分子量為15 517.72，不穩定性指數為19.62，為穩定疏水性蛋白。ORF Finder發現Rv2626c基因全長432 bp，含有5個開放閱讀框，其中最長的一個開放閱讀框顯示Rv2626c基因基本被通讀，全長432 bp，與預測的編碼Hrp1蛋白長度基本相似。綜合利用Protpapram、ProtScale、SOSUI工具預測Hrp1蛋白無信號肽，并通過在線生信軟件可知該蛋白不屬于分泌蛋白，主要定位在結核分枝桿菌的細胞質，在細胞質內發揮功能[11]。其二級結構主要為α-螺旋和無規則卷曲，共占71.33%，生物信息學分析Hrp1蛋白含有6個磷酸化位點，具有良好的抗原優勢表位和氨基酸磷酸化位點，推斷猜想以該蛋白設計疫苗，有助于在潛伏感染期間清除MTB的復發，是探索結核分枝桿菌持久性感染機制的重要研究靶標。該蛋白無規則卷曲占27.27%，表明其容易與抗體嵌合，并預測Hrp1含有多個T細胞的抗原優勢表位。蛋白抗原的二級結構與B細胞表位關系密切[12]，對Hrp1二級結構、親水性、表面可能性、柔韌性和抗原性等進行全面分析，最后結果可知12-18、34-40、76-85、99-114位等4個B細胞表位。目前預測輔助性T細胞表位效果較好且常用的在線生信軟件是SYFPEITHI，本研究篩選中國人群常見的MHC-Ⅱ類分子亞型DRB1* 0101、0401、0701、0801、1101、1501[13]，綜合分析得到的結果對于研究中國人群具有一定的實際意義。經過結果分析發現，本研究對Hrp1抗原蛋白的Th 細胞、CTL 和B細胞抗原表位進行生物信息學預測分析，并應用生物信息學預測分析Hrp1蛋白的結構和功能，發現Hrp1蛋白含有較豐富的B、T細胞抗原表位，為進一步研究該蛋白的功能和明確其在MTB潛伏感染機制中作用提供理論依據，以期為篩選 MTB 診斷標志物和研制新型表位結核疫苗奠定基礎[14]。STRING數據庫分析顯示Hrp1蛋白與Rv2627c、Rv2628、Rv1738、devR、Rv2624c、TB31.7、rip3、pfkB、guaA和hspX有相互作用，該蛋白可能刺激產生NO及細胞因子的過程受轉錄因子NF-kB調控，NO可通過MTB的休眠調節子啟動Rv2626c基因在內的多個下游基因的表達，使MTB進入休眠狀態，抵御宿主免疫系統的殺傷。與抑制蛋白質合成有關，還可能會刺激巨噬細胞和外周血單個核細胞分泌重要的細胞因子[15]。

目前對MTB缺氧相關潛伏期抗原蛋白Hrp1的機制尚不十分清晰明確[16]，深入研究Hrp1的免疫學特性及結構功能特征，對控制結核潛伏感染、預防結核發病和結核免疫治療具有一定意義。本研究對 Hrp1蛋白進行了全面的生物信息學分析，采用多種方式在多個角度進行了分析和預測，有效地規避了單一軟件預測的缺陷，為進一步研究Hrp1蛋白的結構、功能、理化性質提供參考，為進一步揭示結核分枝桿菌的致病機制奠定理論基礎。

利益沖突：無