基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討“黃芪-茯苓-五味子”組方治療糖尿病腎病的作用機(jī)制

滕海英，歐余航，肖建平

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建 福州350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院，福建 福州350108）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN），約占糖尿病患者的40%，是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一，可致腎功能不可逆的損傷，是終末期腎病（ESRD）的主要病因［1］。現(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為：糖尿病腎病與“腎消”“消腎”“下消”密切相關(guān)，且歸經(jīng)定位以腎為主，病機(jī)以“本虛”為主，治療以補(bǔ)氣藥為主，利水滲濕藥、收斂固澀藥等為佐［2］。“黃芪-茯苓-五味子”組方（HFW）作為中醫(yī)常見治療糖尿病腎病的組合，其中黃芪補(bǔ)中益氣，茯苓滲濕健脾，五味子收斂固澀，補(bǔ)腎止遺，兼可補(bǔ)腎氣。馬居里教授［3］治療糖尿病腎病的經(jīng)驗(yàn)方中，用HFW以益氣固表，健脾益腎，祛風(fēng)散邪。王靜［2］在探討糖尿病腎病的古籍文獻(xiàn)用藥規(guī)律后發(fā)現(xiàn)：在錄入的203首方劑中，黃芪、茯苓、五味子的使用頻次最高。HFW能夠有效降低糖尿病腎病患者的尿蛋白和相關(guān)炎癥因子［4］，但其具體的作用機(jī)制尚不明確。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討HFW治療糖尿病腎病的作用機(jī)制，為糖尿病腎病的中醫(yī)臨床治療和實(shí)驗(yàn)研究提供方向和理論支持。

1 方 法

1.1 HFW的活性成分篩選 以“黃芪”“茯苓”“五味子”作為檢索詞在TCMSP數(shù)據(jù)庫［5］（https：／／tcmspw.com／tcmsp.php）檢索，獲得這3味藥的化學(xué)成分信息，按照生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18為篩選條件［6］，篩選出HFW的活性成分。

1.2 HFW的作用靶點(diǎn)篩選 采用TCMSP數(shù)據(jù)庫［5］檢索獲得黃芪、茯苓、五味子中活性成分對應(yīng)的作用靶點(diǎn)，并查詢UniProt數(shù)據(jù)庫［7］（https：／／www.uniprot.org）對獲得的作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因名轉(zhuǎn)換。

1.3 糖尿病腎病的作用靶點(diǎn)篩選 以“diabetic nephropathy”“diabetic kidney disease”作為檢索詞在DisGeNET數(shù)據(jù)庫［8］（https：／／www.disgenet.org／）和GeneCards數(shù)據(jù)庫［9］（https：／／www.genecards.org／）檢索出糖尿病腎病作用靶點(diǎn)。將DisGeNET數(shù)據(jù)庫中相關(guān)性得分（Score）≥0.2［10］和GeneCards數(shù)據(jù)庫中Score≥20［11］的基因整理匯總，獲得糖尿病腎病的作用靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建HFW活性成分-糖尿病腎病共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 將HFW活性成分作用靶點(diǎn)和糖尿病腎病作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0軟件（https：／／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny），獲得HFW和糖尿病腎病的共同靶點(diǎn)；通過Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)行可視化分析，構(gòu)建“HFW活性成分-糖尿病腎病共同靶點(diǎn)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.5 構(gòu)建蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（PPI）網(wǎng)絡(luò) 將獲得的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String 11.0數(shù)據(jù)庫［12］（https：／／stringdb.org／），設(shè)定物種為“Homo sapiens”，其他參數(shù)選擇默認(rèn)參數(shù)，構(gòu)建HFW治療糖尿病腎病共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，以分析共同靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。

1.6 GO和KEGG富集分析 通過DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫［13］（https：／／david.ncifcrf.gov）在線將共同靶點(diǎn)進(jìn)行基因ID轉(zhuǎn)換，利用R語言3.6.1軟件和Bioconductor數(shù)據(jù)庫的org.Hs.eg.db包和clusterProfiler包［14］對共同靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）及分子功能（MF）的GO注釋分析和KEGG通路富集分析，以校正后P值＜0.05為條件進(jìn)行篩選，以分析HFW治療糖尿病腎病潛在作用靶點(diǎn)可能參與的生物學(xué)過程和信號通路。

2 結(jié) 果

2.1 HFW的作用靶點(diǎn) 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫對HFW化學(xué)成分進(jìn)行篩選，根據(jù)設(shè)定的DL、OB參數(shù)，篩選出43個(gè)活性成分，其中黃芪20個(gè)，茯苓15個(gè)，五味子8個(gè)，剔除重復(fù)項(xiàng)，獲得42個(gè)活性成分。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索獲得HFW的活性成分對應(yīng)的作用靶點(diǎn)，進(jìn)行基因名轉(zhuǎn)換后，剔除重復(fù)項(xiàng)，獲得185個(gè)活性成分作用靶點(diǎn)。

2.2 糖尿病腎病的作用靶點(diǎn) 通過檢索DisGeNET和GeneCards數(shù)據(jù)庫，根據(jù)設(shè)定的Score參數(shù)，檢索出糖尿病腎病的作用靶點(diǎn)分別為153個(gè)和225個(gè)，剔除重復(fù)項(xiàng)后，獲得糖尿病腎病的作用靶點(diǎn)334個(gè)。

2.3 活性成分-共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將篩選得到的334個(gè)糖尿病腎病作用靶點(diǎn)與185個(gè)HFW活性成分作用靶點(diǎn)取交集，獲得48個(gè)共同靶點(diǎn)。48個(gè)共同靶點(diǎn)基因?qū)?yīng)的HFW活性成分有17個(gè)，見表1。由此推測HFW的17個(gè)活性成分通過這48個(gè)共同靶點(diǎn)治療糖尿病腎病。將17個(gè)活性成分和48個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件，構(gòu)建“HFW活性成分-糖尿病腎病共同靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)，見圖1。

表1 HFW的活性成分

圖1 “HFW活性成分-糖尿病腎病共同靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過String數(shù)據(jù)庫在線構(gòu)建的HFW治療糖尿病腎病共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，包含48個(gè)節(jié)點(diǎn)和584條邊，見圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在48個(gè)共同靶點(diǎn)中自由度（degree）值排名前10位分別是AKT1、IL6、VEGFA、CASP3、PTGS2、MMP9、EGF、NOS3、CCL2、IL1B，其中自由度值最高的是AKT1，自由度值為45，其次是IL6，自由度值為44。提示這些靶點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)中占有重要地位，是HFW治療糖尿病腎病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖2 共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO富集分析 GO功能富集分析共涉及1 324個(gè)BP、19種CC、78個(gè)MF，根據(jù)富集基因數(shù)目，選擇排名前10位的功能注釋信息，并繪制柱狀圖，見圖3。結(jié)果顯示：HFW治療糖尿病腎病可能與營養(yǎng)水平反應(yīng)、氧水平反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)等BP有關(guān)；CC涉及到膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)域等多細(xì)胞成分；MF涉及到細(xì)胞因子受體結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、整合素結(jié)合等。

圖3 共同靶點(diǎn)的GO富集分析圖

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析共獲得105條富集通路，列出富集基因最多的前10條信號通路，見表2。KEGG富集的信號通路主要包括AGE-RAGE信號通路、液體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、癌癥蛋白聚糖、TNF信號通路等。

表2 KEGG通路富集分析中富集基因最多的前10名富集通路

3 討 論

糖尿病腎病主要病因是繼發(fā)于糖尿病，其自然病史包括腎小球超濾、進(jìn)行性白蛋白尿、GFR下降以及最終出現(xiàn)的ESRD［1］，炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和氧化應(yīng)激在糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展中起著核心作用［15］。目前研究認(rèn)為：與糖尿病腎病中炎癥反應(yīng)機(jī)制密切相關(guān)的因子包括轉(zhuǎn)錄因子、促炎細(xì)胞因子、趨化因子［16］。機(jī)體在糖尿病特殊環(huán)境下，免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子以及自身抗體等免疫因素相互影響，造成腎功能的損害［17］。氧化應(yīng)激可改變腎臟血流動(dòng)力學(xué)，損傷腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致基質(zhì)在系膜細(xì)胞外沉積及增厚腎小球基底膜［18］。本研究通過對HFW活性成分與糖尿病腎病的共同靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)和富集分析，發(fā)現(xiàn)HFW治療糖尿病腎病主要與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和氧化應(yīng)激相關(guān)，同時(shí)還和細(xì)胞增殖與凋亡的過程有關(guān)。

本研究通過構(gòu)建“HFW活性成分-糖尿病腎病共同靶點(diǎn)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，顯示HFW通過17種化合物靶向48個(gè)共同靶點(diǎn)。其中，作用較多靶點(diǎn)的活性成分有槲皮素、山奈酚、異鼠李素、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素，這些化合物可能是HFW治療糖尿病腎病的關(guān)鍵藥物。

近年來，槲皮素和山奈酚作為治療糖尿病腎病的藥物已引起了廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)：糖尿病腎病C57BL／6J模型小鼠口服低劑量槲皮素治療顯示出抗氧化、抗凋亡和腎保護(hù)作用［19］，另有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過激活Hippo途徑抑制高糖誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞的增殖［20］；山奈酚可通過增加GLP-1、胰島素的釋放和抑制RhoA／Rho激酶來改善糖尿病引起的腎臟損傷和纖維化［21］；異鼠李素抑制NFκB信號傳導(dǎo)活性，降低炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，起到對糖尿病大鼠的腎臟保護(hù)作用［22］；毛蕊異黃酮通過體內(nèi)和體外NF-κB途徑改善糖尿病誘導(dǎo)的腎臟炎癥［23］；芒柄花黃素可增加SIRT1在2型糖尿病大鼠腎組織中的表達(dá)而減輕腎臟損害［24］。

HFW治療糖尿病腎病的共同靶點(diǎn)主要富集在AGE-RAGE、TNF、HIF-1、IL-17、VEGF等信號通路和液體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、癌癥蛋白聚糖上。AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中發(fā)揮著重要的作用，也是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的重要一環(huán)［25］。有研究認(rèn)為：AGE受體和RAGE受體與其配體的結(jié)合在腎臟組織中引起氧化應(yīng)激和慢性炎癥反應(yīng)將導(dǎo)致腎功能喪失，可通過阻斷AGE-RAGE信號通路改善糖尿病腎病進(jìn)展［26］。KEGG分析結(jié)果顯示富集在AGE-RAGE信號通路上的AKT1、IL6、VEGFA、CASP3、NOS3、CCL2、IL1B在PPI網(wǎng)絡(luò)中有較高的自由度值，可見這些靶點(diǎn)是HFW治療糖尿病腎病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。其中AKT1參與多種生物學(xué)過程，其過度激活可影響葡萄糖體內(nèi) 穩(wěn) 定［27］，也 可 發(fā) 揮 抗 凋 亡 及 抗 氧 化 應(yīng) 激 作 用［28］；NOS3可能會(huì)造成一氧化氮合成的異常，影響糖尿病 腎 病 的 進(jìn) 程［29］；IL6、VEGFA、CASP3、CCL2、IL1B均為參與指導(dǎo)或者介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的潛在核心靶點(diǎn)［30-33］。TNF信號通路在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡中具有至關(guān)重要的作用，TNF受體誘導(dǎo)NF-κB信號傳導(dǎo)異常導(dǎo)致慢性炎癥，從而促使糖尿病腎損傷的發(fā)生［34］。HIF-1作為氧穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)劑，主要參與循環(huán)系統(tǒng)疾病的缺氧代償反應(yīng)、免疫反應(yīng)、新生血管的生成與調(diào)節(jié)等［35］，HIF-1信號通路上的關(guān)鍵靶點(diǎn)HIF-1α可介導(dǎo)與腎間質(zhì)細(xì)胞纖維化有關(guān)的多種細(xì)胞因子的表達(dá)。研究表明可通過抑制HIF-1α的表達(dá)，進(jìn)而抑制高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞的炎癥和纖維化［36］。IL-17信號通路被認(rèn)為與多種免疫疾病和慢性炎癥有關(guān)［37］，研究發(fā)現(xiàn)IL-17A可抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活劑的磷酸化，可有效治療、預(yù)防和逆轉(zhuǎn)糖尿病遺傳模型中已建立的腎病［38］。血管生成的過度和不足都與糖尿病并發(fā)癥的進(jìn)展有關(guān)，VEGF是參與新血管形成的關(guān)鍵介質(zhì)。研究表明通過抑制VEGF信號傳導(dǎo)可降低腎臟的脂毒性，使足細(xì)胞對胰島素信號傳導(dǎo)重新敏感，抑制糖尿病腎病的發(fā)展，并預(yù)防腎功能不全［39］。這些信號通路在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中均占有重要的位置。本研究KEGG富集分析結(jié)果表明HFW可能通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡，從而起到治療糖尿病腎病作用。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討HFW治療糖尿病腎病的潛在作用機(jī)制，結(jié)果表明：HFW發(fā)揮糖尿病腎病的治療作用可能通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡。本研究為進(jìn)一步研究HFW治療糖尿病腎病提供臨床和實(shí)驗(yàn)的參考依據(jù)，但不足之處是未考慮中藥的提取方法、劑型劑量等因素的影響。