升降利咽合劑提取工藝研究

邱水生，羅花彩，黃 燕，潘旭東

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州350004）

加味升降散為我院臨床驗方，是在清·楊璇《傷寒溫疫條辨》所收載的升降散處方基礎(chǔ)上加減而成，處方由淡豆豉、焦梔子、連翹、薄荷、僵蠶、蟬蛻、姜黃、大黃等組成，具有升清降濁、行氣散瘀、清熱解毒、利咽消腫的功效，可有效治療咽喉腫痛［1］。加味升降散臨床療效確切，但因湯劑使用不便，我院擬將其開發(fā)為升降利咽合劑，申請院內(nèi)制劑批文，便于臨床使用。本研究采用正交試驗對處方中姜黃、薄荷揮發(fā)油的水蒸氣蒸餾法提取工藝進(jìn)行考察，采用星點設(shè)計-響應(yīng)面法對升降利咽合劑的水提工藝進(jìn)行考察，優(yōu)選升降利咽合劑的提取工藝，以期為升降利咽合劑的深入開發(fā)提供參考。

1 儀 器

Sartorius CPA225D電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；Dionex ULtimate 3000高效液相色譜儀和UV檢測器（美國DIONEX公司）；KQ-500DE超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 試 藥

梔子苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110749-201919，含量：97.1%）；連翹苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110821-201816，含量：95.1%）；僵蠶（廣東匯群中藥飲片股份有限公司，產(chǎn)地：浙江省衢州市，批號：2019020101）；蟬蛻（廣東匯群中藥飲片股份有限公司，產(chǎn)地：安徽省亳州市，批號：190201）；姜黃（安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司，產(chǎn)地：四川省樂山市，批號：19011103）；大黃（安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司，產(chǎn)地：甘肅省隴南市，批號：19091107）；淡豆豉（亳州市滬譙藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地：安徽省黃山市，批號：1905290362）；焦梔子（安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司，產(chǎn)地：江西省撫州市，批號：19071735）；連翹（安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司，產(chǎn)地：山西省運(yùn)城市，批號：19122503）；薄荷（安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司，產(chǎn)地：安徽省阜陽市，批號：20030205）。以上中藥飲片購自福建承創(chuàng)堂中藥有限公司，由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院林雄主任中藥師鑒定符合《中華人民共和國藥典（一部）》2020版規(guī)定。乙腈（色譜純，上海麥克林生化有限公司）；其余試劑為分析純，水為純化水。

3 方法與結(jié)果

3.1 總提取工藝 處方中姜黃、薄荷二味飲片，用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油備用，藥液濾取備用，藥渣與處方中其余飲片一起進(jìn)行水提。水提液與上述藥液合并，濃縮至一定量后，冷卻，加入揮發(fā)油，加純化水定容。

3.2 揮發(fā)油提取工藝研究

3.2.1 薄荷、姜黃飲片吸水率的考察 稱取5倍處方量的薄荷、姜黃飲片共75 g，置1 000 mL具塞量筒中，加入10倍量水，密塞，靜置6 h，濾過［2］，量取濾液體積，按吸水率＝（加水量－濾液量）／飲片質(zhì)量×100%計算，結(jié)果吸水率為246%。

3.2.2 揮發(fā)油提取與測定 取5倍處方量薄荷、姜黃飲片共75 g，置2 000 mL燒瓶中，加入10倍量水，補(bǔ)足吸水量，浸泡，連接揮發(fā)油提取器與回流冷凝管，采用水蒸氣蒸餾法提取，按2020版《中華人民共和國藥典（四部）》［3］中揮發(fā)油測定法甲法進(jìn)行測定。自冷凝管上端加水使水充滿揮發(fā)油測定器的刻度部分，并溢入燒瓶時為止；電熱套緩緩加熱至沸，開始計時，保持相應(yīng)時間，停止加熱，放置1 h，讀取揮發(fā)油量。

3.2.3 正交實驗設(shè)計 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，以提取時間（A）、浸泡時間（B）、加水量（C）為考察因素，每個因素選取3個水平進(jìn)行正交試驗，以揮發(fā)油量為考察指標(biāo)，并對結(jié)果進(jìn)行方差分析，因素水平見表1，實驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2直觀分析和表3方差分析結(jié)果表明：以揮發(fā)油量為考察指標(biāo)時，各因素對揮發(fā)油量影響大小的順序為A＞B＞C，其中因素A對試驗結(jié)果具有顯著性影響（P＜0.05），故選擇A3；因素B和C未對試驗結(jié)果產(chǎn)生顯著性影響（P＞0.05），選擇均值最大。故最佳提取工藝為A3B2C2，即飲片加入8倍量水且補(bǔ)足吸水量，浸泡1 h，水蒸氣回流提取6 h。

3.2.4 試驗驗證 稱取5倍處方量的姜黃和薄荷飲片共3份，按照最優(yōu)的提取工藝進(jìn)行驗證，結(jié)果所得揮發(fā)油量分別為1.10、1.12、1.15 mL，平均值為1.12 mL，可知該方法穩(wěn)定可行。

3.3 升降利咽合劑水溶性成分提取工藝研究

3.3.1 除薄荷、姜黃外其他飲片吸水率的考察 稱取處方量除薄荷、姜黃外的其他飲片共60 g，置1 000 mL具塞量筒中，加入10倍量水，密塞，靜置6 h，濾過，量取濾液體積。按吸水率＝（加水量－濾液量）／飲片質(zhì)量×100%計算，結(jié)果吸水率為220%。

3.3.2 水提液的制備 稱取2倍處方量飲片，薄荷、姜黃兩味飲片加入8倍量水，并補(bǔ)足吸水量，浸泡1 h，水蒸氣蒸餾提取6 h，收集揮發(fā)油，蒸餾后的水溶液濾取備用；薄荷、姜黃藥渣與其余飲片加入10倍量水，補(bǔ)足吸水量，第一次煎煮前浸泡0.5 h，煎煮2次，每次1 h；合并濾液與蒸餾后水溶液，濃縮至150 mL，靜置24 h，離心，濃縮至120 mL，待藥液冷卻后加入揮發(fā)油，攪勻，加純化水定容至150 mL。

3.3.3 梔子苷含量測定

3.3.3.1 梔子苷測定色譜條件 色譜柱：EcoPak 120 C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；柱溫：30℃；流動相：乙腈-水（13∶87）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：237 nm；進(jìn)樣量：10μL。理論塔板數(shù)按梔子苷計，應(yīng)不低于4 500。

3.3.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取梔子苷對照品適量，加甲醇溶解配制成0.098 1 mg／mL對照品溶液，備用。

3.3.3.3 供試品溶液的制備 精密吸取藥液1 mL置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密稱定；超聲處理30 min，精密稱定，加甲醇補(bǔ)足減失的重量，藥液移至離心管，離心30 min，取上清液過0.45μm微孔濾膜，即得。

3.3.3.4 升降利咽合劑缺焦梔子陰性對照溶液制備 按處方比例稱取2倍量除焦梔子以外的其他飲片，按“3.3.2”項下工藝提取，再按“3.3.3.3”項下制備，即得。

3.3.3.5 專屬試驗 取梔子苷對照品溶液、“3.3.3.3”項下供試品溶液、“3.3.3.4”項下缺焦梔子陰性對照溶液進(jìn)樣，按“3.3.3.1”項下色譜條件分析，結(jié)果見圖1。圖1可見陰性對照溶液在梔子苷色譜峰保留時間處無吸收，表明處方中其他藥味無干擾。

圖1 梔子苷HPLC色譜圖

3.3.3.6 線性關(guān)系的考察 精密吸取“3.3.3.2”項下梔 子 苷 對 照 品 溶 液6、8、10、12、14、16、18μL，按“3.3.3.1”項下色譜條件進(jìn)行測定。以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。梔子苷：Y＝21.659X＋2.228（r＝0.999 5），結(jié)果表明梔子苷在0.588 6～1.765 8μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.3.3.7 精密度試驗 精密吸取“3.3.3.2”項下梔子苷對照品溶液，按“3.3.3.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄梔子苷的峰面積，RSD為0.57%，表明精密度良好。

3.3.3.8 重復(fù)性試驗 按“3.3.3.3”項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液6份，按“3.3.3.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積并計算樣品梔子苷含量。結(jié)果：梔子苷平均含量為3.174 9 mg／mL，RSD為1.96%，表明本方法重復(fù)性良好。

3.3.3.9 穩(wěn)定性試驗 取“3.3.3.3”項下供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣，按“3.3.3.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄梔子苷的峰面積，RSD為1.39%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.3.3.10 加樣回收率試驗 取已知濃度的待測溶液0.5 mL置25 mL量瓶中，精密加入1.802 1 mg梔子苷對照品，再按“3.3.3.3”項下制備供試品溶液，按“3.3.3.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積并計算樣品含量，計算回收率，結(jié)果見表4。

3.3.4 連翹苷含量測定

3.3.4.1 色譜條件 色譜柱：EcoPak 120C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；柱溫：30℃；流動相：乙腈-水（25∶75）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：277 nm；進(jìn)樣量：10μL。理論塔板數(shù)按連翹苷計，應(yīng)不低于4 000。

3.3.4.2 對照品溶液的制備 精密稱定連翹苷對照品適量，加甲醇溶解配制成0.190 2 mg／mL對照品溶液，備用。

3.3.4.3 供試品溶液的制備 精密吸取藥液2 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密稱定；超聲處理30 min，精密稱定，加甲醇補(bǔ)足減失的重量，藥液移至離心管，離心30 min，取上清液過0.45μm微孔濾膜，即得。

3.3.4.4 升降利咽合劑缺連翹陰性對照溶液制備

按處方比例稱取2倍量除連翹以外的其他飲片，按“3.3.2”項下工藝提取，再按“3.3.4.3”項下制備，即得。

3.3.4.5 專屬試驗 取連翹苷對照品溶液、“3.3.4.3”項下供試品溶液、“3.3.4.4”項下缺連翹陰性對照溶液進(jìn)樣，按“3.3.4.1”項下色譜條件分析，結(jié)果見圖2。圖2可見陰性對照溶液在連翹苷色譜峰保留時間處無吸收，表明處方中其他藥味無干擾。

圖2 連翹苷HPLC色譜圖

3.3.4.6 線性關(guān)系的考察 精密吸取“3.3.4.2”項下連翹苷對照品溶液4、6、8、10、12、14μL，按“3.3.4.1”項下色譜條件進(jìn)行分析。以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。連翹苷：Y＝10.825X＋0.364（r＝0.999 8）。結(jié)果表明連翹苷在0.760 8～2.662 8μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.3.4.7 精密度試驗 精密吸取“3.3.4.2”項下連翹苷對照品溶液，按“3.3.4.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄連翹苷的峰面積，RSD為0.62%，表明精密度良好。

3.3.4.8 重復(fù)性試驗 按“3.3.4.3”供試品溶液制備方法制備供試品溶液6份，按“3.3.4.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積并計算樣品連翹苷含量。結(jié)果：連翹苷平均含量為0.737 8 mg／mL，RSD為1.32%，表明本方法重復(fù)性良好。

3.3.4.9 穩(wěn)定性試驗 取“3.3.4.3”項下供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣，按“3.3.4.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄連翹苷的峰面積，RSD為1.18%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.3.4.10 加樣回收率試驗 取已知濃度的待測溶液1 mL，分別取精密加入0.370 9 mg連翹苷對照品，按“3.3.4.3”項下制備供試品溶液，按“3.3.4.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積并計算樣品含量，計算回收率，結(jié)果見表4。

表4 梔子苷、連翹苷加樣回收率試驗結(jié)果

3.3.5 干浸膏率的測定 取提取液25 mL于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，至105℃烘箱中干燥3 h［4］，取出置干燥器冷卻至室溫，稱重并計算干浸膏率。

3.3.6 星點設(shè)計-響應(yīng)面法實驗與結(jié)果 因提取次數(shù)為非連續(xù)性變量，回歸處理較困難，所以結(jié)合傳統(tǒng)湯劑實際煎煮次數(shù)及預(yù)實驗結(jié)果，固定提取次數(shù)為2次。選取提取時間（A）和加水量（B）為考察因素，每個因素確定5個水平，采用Design Expert 8.0統(tǒng)計軟件，以梔子苷含量、連翹苷含量、干浸膏率的綜合評分（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化實驗，選取最佳提取工藝參數(shù)［5］。提取因素與水平見表5，實驗設(shè)計及結(jié)果見表6。

表5 升降利咽合劑水提部位提取因素與水平表

表6 升降利咽合劑水提部位提取實驗設(shè)計與結(jié)果

3.3.7 模型擬合及方差分析 通過Design-Expert 8.0軟件對表6數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以綜合評分為指標(biāo)進(jìn)行二項擬合，得到方程：Y＝46.594 81＋27.732 04A＋4.638 27B＋1.246 67AB－15.873 00A2－0.242 03B2（r＝0.932 1，P＜0.01），方差分析見表7。由表7可知，模型具有非常顯著性差異（P＜0.01），而失擬項無顯著性差異（P＞0.05），表明模型的非線性擬合效果良好，能比較準(zhǔn)確地預(yù)測實際情況。

3.3.8 升降利咽合劑水溶性成分提取工藝的確定

根據(jù)回歸方程，繪制相應(yīng)的三維響應(yīng)曲面圖、二維等高圖，見圖3、圖4。根據(jù)星點設(shè)計－響應(yīng)面法試驗結(jié)果，升降利咽合劑水提液最優(yōu)提取工藝為加入13.16倍水，煎煮1.39 h。綜合考慮經(jīng)濟(jì)成本及后期大規(guī)模生產(chǎn)的可行性，確定升降利咽合劑水提液最優(yōu)工藝為加入13倍水，煎煮80 min，煎煮2次。

圖3 水溶性成分提取的三維響應(yīng)曲面圖

圖4 水溶性成分提取的二維等高圖

3.3.9 驗證實驗 依照星點設(shè)計－響應(yīng)面法試驗設(shè)計優(yōu)選的最佳提取工藝進(jìn)行驗證，平行3次，測定梔子苷含量、連翹苷含量、干浸膏率，并計算綜合評分，結(jié)果見表8。預(yù)測值與實測值偏差較小，可知所建立模型預(yù)測性、優(yōu)化工藝重復(fù)性良好，具有可行性。參考文獻(xiàn)［6］，計算公式：

表8 驗證實驗結(jié)果

4 討 論

加味升降散在湯劑煎煮過程中，含有揮發(fā)性成分飲片如薄荷雖然后入，但相應(yīng)揮發(fā)性成分亦只是少部分存在于藥液中，大部分揮發(fā)損失。故在將其改為升降利咽合劑時，生產(chǎn)工藝設(shè)計中先提取薄荷、姜黃所含揮發(fā)油，留取濾液，藥渣與剩余飲片再一并提取，濾液合并，濃縮后加入揮發(fā)油，盡最大力度保存藥用成分，以達(dá)到更好的療效。

本試驗采用正交設(shè)計實驗優(yōu)選揮發(fā)油的提取工藝，以浸泡時間、提取時間、加水量為考察因素，以揮發(fā)油量為考察指標(biāo)；采用星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)選升降利咽合劑的水提工藝，以加水量、提取時間為考察因素，測得梔子苷含量、連翹苷含量及干浸膏率，并對此3個指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)綜合評分，以綜合評分為評價指標(biāo)，最終確定升降利咽合劑的最佳提取工藝為：加入8倍薄荷、姜黃飲片量的水，補(bǔ)足吸水量，浸泡1 h，水蒸氣回流提取6 h，收集揮發(fā)油，藥液濾取留用；藥渣與其余飲片一起進(jìn)行水提，加入13倍飲片量的水，補(bǔ)足吸水量，浸泡0.5 h，煎煮2次，每次80 min；水提液與上述藥液合并，濃縮至一定量后，冷卻，加入揮發(fā)油，加純化水定容。對生產(chǎn)工藝進(jìn)行驗證，結(jié)果表明本工藝經(jīng)濟(jì)、合理、重現(xiàn)性好，適用于規(guī)模化生產(chǎn)。