基于計算機模擬技術探討當歸活血和止痛作用的活性成分及其關聯性

鄭春松，段辛威，王圣杰，朱曉勤，付長龍，葉蕻芝*

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州350122）

當歸具辛味，辛散善行，既能入血分，又能入氣分，是活血行氣的要藥，有良好的止痛作用，《中藥學》［1］記載其具有活血止痛的功效，即從中醫的角度提示當歸活血和止痛功效存在關聯性，但是，用現代的語言來描述其功效及這種關聯性未見報道。本研究擬利用基于分子對接、數據庫全局指紋相似度和生物網絡相結合的計算機模擬方法［2-4］，從活性成分的角度研究當歸活血和止痛的功效及其之間的關聯性，為現代醫學理解當歸功效提供幫助，也為當歸的臨床應用及深入開發提供線索。

1 方法

1.1 當歸化學成分結構數據集建立 在中藥系統藥理學數據庫及分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）網站中herb name一欄選擇“當歸”［5］，檢索當歸的化學成分125個并下載其文件。在discovery studio 2.0（簡稱DS2.0）模擬平臺上［6］轉化成三維分子結構，用默克分子力場（Merck molecular force field，MMFF）力場優化［7］，建立當歸的化學成分結構數據集sd文件。

1.2 當歸活血、止痛功效的活性成分篩選 根據活血類、止痛類靶點的相關文獻［3］和［4］，確定凝血酶（Thrombin）、血栓素A2受體（TXA2R）、纖溶酶原激活物抑制物1型（PAI-1）、凝血因子Ⅸa（FactorⅨa）為活血功效的靶點，p38、腫瘤壞死因子α（TNFα）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、磷酸二酯酶4A（PDE4A）為止痛功效的靶點，從RCSB Protein Data Bank［8］上下載其蛋白質-配體復合物三維結構，見表1。在DS模擬平臺上，使用Hierarchy和Chemistry模塊對蛋白結構去溶劑、去配體、加氫處理后，在Binding Site模塊中用活性原配體來確定活性位點，并使用DS LigandFit模塊進行當歸化學成分和受體的對接［9］；對接成功后，以各自原配體的DOCKSCORE為閾值，大于閾值的化合物分別視為當歸活血功效和止痛功效的活性成分［4］。

表1 與活血、止痛功效有關的蛋白質-配體復合物三維結構信息

1.3 當歸活血、止痛功效的關聯性分析 在DS模擬平臺上構建當歸活血、止痛功效的活性成分結構數據集，在DSCompare Libraries模塊生成兩活性成分結構數據集的全局指紋（global fingerprint），計算兩者的Tanimoto相似系數（tanimoto similarity coefficient）［2］，其系數范圍為0～1。當系數為0時，表示兩數據集結構間沒有相同的字節編碼；當系數為1時，則表示有相同的字節編碼，意味著有相同的分子結構片斷。即系數越接近1，代表兩數據集在分子結構特征方面的相似度越好。鑒于藥物的結構信息能在一定程度上反映功能信息［10-11］，故分子結構特征相似性在一定程度上可以反映當歸活血功效與止痛功效之間的關聯性。

1.4 當歸活血、止痛功效的活性成分與靶點相互作用的可視化網絡 將當歸活性成分及其作用靶點視為節點，兩者的相互作用用連接線表示，采用Cytoscape軟件［12］構建活血、止痛功效的活性成分-靶點可視化網絡。通過其Plugins模塊的Network Analysis分析網絡中節點的度值，以度值≥3的節點視為網絡中的重要活性成分和靶點，進一步揭示當歸活血功效與止痛功效在活性成分上的聯系。

2 結 果

2.1 當歸活血、止痛功效的活性成分 分別以活血功效的靶點Thrombin、TXA2R、PAI-1、FactorⅨa與各自原配體對接的DOCK-SCORE等于50.672、58.721、47.613和46.187為閾值，從當歸中篩選到6個、1個、3個和6個活性化合物，見表2；分別以止痛功效的靶點p38、TNF-α、iNOS、PDE4A與各自原配體對接的DOCK-SCORE等于77.556、52.564、50.743、45.415為閾值，從當歸中篩選到1個、4個、5個和15個活性化合物，見表3。結果顯示活血與止痛功效之間存在6個共同活性成分，分別為阿魏酸松柏酯、歐當歸內酯A、7，10-十五碳二炔酸、異漢防己堿、磷脂酰肌醇和6，7，3'，8'-雙藁本內酯，屬于苯酞類、磷酯類、生物堿類和有機酸類等。而且，從共同活性成分數目與各自功效活性成分總數進一步分析，75%活血功效的活性成分具有止痛作用，但僅約35%止痛功效的活性成分具有活血作用。

表2 當歸活血功效的活性成分及其作用靶點

表3 當歸止痛功效的活性成分及其作用靶點

2.2 當歸活血、止痛功效的關聯性 在生成當歸活血、止痛功效的活性成分各自結構數據集的全局指紋后計算Tanimoto相似系數，結果顯示兩者相似度分值為0.7736，提示兩個功效在活性成分結構特征上具有很好的相似性，即當歸的活血功效與止痛功效的藥理作用存在關聯性。

2.3 當歸活血、止痛功效的活性成分與靶點相互作用可視化網絡 在Cytoscape平臺進行當歸活血與止痛功效的活性成分與靶點相互作用可視化，見圖1和圖2。結果顯示：當歸活血功效的活性成分-靶點網絡中含有12個節點和16條邊，當歸止痛功效的活性成分-靶點網絡中含有21個節點和25條邊，2個網絡都顯示了“一對多，多對一”的特點。當歸活血功效的重要活性成分為異漢防己堿、歐當歸內酯A和阿魏酸松柏酯，重要靶點為Thrombin、FactorⅨa和PAI-1；當歸止痛功效的重要活性成分為歐當歸內酯A和阿魏酸松柏酯，重要靶點為PDE4A、iNOS和TNF-α。見表4。

表4 當歸活血、止痛功效的重要活性成分和靶點

圖1 當歸活血功效的活性成分-靶點網絡

圖2 當歸止痛功效的活性成分-靶點網絡

3 討 論

中藥功效是在中醫藥理論基礎上對中藥臨床作用的總結，是對中藥特征最本質的描述，但因其概念的內涵和外延與現代藥效學指標存在實質性差異，影響到西醫對中藥功效的理解［13］。在此背景下，國內學者認為中藥基本是以混合物的作用為一個功效單位，化學成分是溝通中醫和西醫的橋梁，提出了中藥的“成分-藥理活性-中藥功效”的可視化研究策略［14－15］。因此，本文以當歸為例，利用分子對接方法，分析其活血功效和止血功效的活性成分；并從全局指紋特征的相似性，分析兩功效的活性成分數據集在分子結構特征上的相似度，從而揭示兩功效之間的關聯性；并通過活性成分-靶點網絡進行可視化，為從現代醫學角度闡釋傳統中藥功效提供示范作用。

分子對接作為計算機模擬的重要技術之一，已經成功應用于中藥活性成分的篩選研究［16］。表2和表3分別顯示當歸中含有8個活血功效的活性成分和17個止痛功效的活性成分，其中，阿魏酸的鎮痛作用已經報道［17］。從活性成分的種類看，當歸可通過不同類型化合物組成的分子群達到活血或止痛的作用，例如，當歸苯酞類成分6，7，3'，8'-雙藁本內酯和生物堿類成分異漢防己堿具有活血和止痛的功效。從2種活性成分的關聯性看，很大比例的當歸活血功效活性成分可以達到止痛的功效，即存在促進關系，例如，活血的活性成分阿魏酸松柏酯也能達到止痛的功效，這給“在臨床上，四物湯在增加桃仁和紅花后，活血力增強的同時，止痛效力也有明顯的促進作用”提供了實驗依據。

根據“結構類似的化合物具有類似的物化性質和生物活性”原理［18-20］，本研究中兩個數據集的相似系數將近0.8，提示當歸活血和止痛功效的活性成分在很大程度上存在相似的藥理作用。在此基礎上，本研究構建了當歸活血、止痛活性成分與靶蛋白相互作用的可視化網絡，圖1和圖2分別直觀顯示了當歸具有多成分-多靶點的活血、止痛作用。作用于活血功效靶點和止痛功效靶點的成分阿魏酸松柏酯，與單獨作用于活血功效靶點的成分豆甾醇組合，可增強活血的功效；另外，與單獨作用于止痛功效靶點的成分洋川芎內酯C組合，可增強止痛的功效。因此，當歸活血功效與止痛功效可通過與既能活血又能止痛活性成分的組合發揮協同作用。

綜述所述，計算機模擬可視化顯示當歸活血功效和止痛功效存在共同的活性成分以及相似的藥理作用，且兩功效之間存在協同作用，為理解當歸活血止痛作用的本質提供了依據。鑒于活血止痛法在骨關節炎治療中的重要性［21］，未來課題組將以當歸中重要活性成分歐當歸內酯A和阿魏酸松柏酯為對象，通過實驗證實其活血、止痛作用，以及兩成分配伍后在治療骨關節炎中的協同作用，促進當歸治療骨關節炎的新藥研發，并完善基于化學-藥理-功效屬性結合的中西醫結合功效辨識的方法，服務于中藥的現代化。