滅草松對穗狀狐尾藻的毒性研究

吳 遲，孫 田，何明遠(yuǎn)，蔣紅云，張 蘭，張燕寧，毛連綱，朱麗珍，鄭永權(quán)，劉新剛*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193；2.廣西思浦林科技有限公司，南寧 530001）

水生植物在水體凈化、環(huán)境監(jiān)測等方面起著重要作用，利用水生植物進(jìn)行農(nóng)藥毒性評價等相關(guān)工作也日益受到國內(nèi)外研究人員的重視。穗狀狐尾藻屬小二仙草科，狐尾藻屬，是一種多年生雙子葉沉水植物，在我國各地池塘，溝渠中均有生長，具有改善水體物理環(huán)境，富集鐵、鈷等金屬，凈化水體，維持水體生物多樣性等作用[1-3]。目前，穗狀狐尾藻已被我國和OECD（經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織）作為標(biāo)準(zhǔn)生物用于化學(xué)農(nóng)藥的毒性測試。滅草松，又名苯達(dá)松，于20世紀(jì)60年代由巴斯夫公司開發(fā)，在1972年上市的農(nóng)藥品種。其主要用于防除水稻、玉米、大豆、花生等田中的闊葉雜草和莎草科雜草，是一種選擇性觸殺型苗后除草劑，通過葉片接觸和根系吸收，傳導(dǎo)到莖葉，阻礙植物進(jìn)行光合作用和水分代謝，使植物因生理機(jī)能失調(diào)而死。自2009年起，滅草松的銷售額保持穩(wěn)步增長趨勢，在世界水稻除草劑市場占據(jù)重要地位[4-5]。因此，筆者采用水相染毒的方法，以明確滅草松對穗狀狐尾藻的毒性效應(yīng)，并為滅草松的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險評估提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試藥劑

96.3%滅草松原藥（bentazone），江蘇瑞邦農(nóng)藥廠有限公司。

1.1.2 供試生物

穗狀狐尾藻，水生藻安生物科技有限公司。試驗前在水-沉積物系統(tǒng)中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)7 d，生長狀態(tài)良好，有根生成，無藻類污染。每天光照16 h，溫度為20±2℃。

1.1.3 儀器設(shè)備

分析天平、半微量天平、便攜式pH計、便攜式溶解氧測定儀，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；組培架，北京中科起源科技有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀、InertSustain C18色譜柱，島津企業(yè)管理（中國）有限公司。

1.2 試驗方法

本研究主要根據(jù)OECD準(zhǔn)則（No.239）[6]，采用水相染毒的方法，進(jìn)行滅草松對穗狀狐尾藻的毒性效應(yīng)研究，并建立分析方法對滅草松進(jìn)行真實濃度檢測。

1.2.1 穗狀狐尾藻毒性試驗

按照等比序列設(shè)置了有效劑量為0.300、0.600、1.20、2.40、4.80、9.60 mg/L等6個試驗處理，同時設(shè)空白對照組。對照組設(shè)6次重復(fù)，處理組設(shè)4次重復(fù)，每重復(fù)3棵藻。試驗期間，每天光照16 h，溫度為20±2℃，隨時補充水分，溶液變化量保持在10%以內(nèi)。14 d時，測量植物主莖，側(cè)枝和根部的長度，同時測量植物地上部分和根部的鮮重。然后，于60℃條件下，將植物烘干至恒重，測量地上部分和根部的干重。試驗結(jié)束后，計算14 d-EC50值。

1.2.2 分析方法建立

1.2.2.1 儀器方法

采用島津LC-20AT高效液相色譜儀對滅草松進(jìn)行真實濃度檢測。儀器條件如下：色譜柱為InertSustain C18（4.6×150 mm，5μm），進(jìn)樣體積為10 μL，柱溫箱為40℃，流動相為乙腈∶0.1%磷酸水溶液（V∶V=40∶60），流速為1.000 mL/min，檢測器為紫外檢測器SPD-20A，檢測波長為230 nm，保留時間為7.70 min。

1.2.2.2 前處理方法

水樣直接過0.22μm濾膜，上機(jī)檢測。

1.2.2.3 水樣檢測

在試驗開始0、7 d更換試驗藥液前后和14 d時，從對照組和處理組試驗溶液中部取樣檢測。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)計算生物量增長抑制率和平均生長率抑制率，計算公式參照OECD準(zhǔn)則（No.239）[6]，并采用統(tǒng)計軟件SPSS17.0概率回歸分析[7]計算滅草松對穗狀狐尾藻的半效應(yīng)濃度EC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅草松真實濃度檢測

在試驗開始0、7 d更換試驗藥液前后和14 d時采集試驗溶液并對滅草松進(jìn)行真實濃度檢測。試驗期間，實測濃度與理論濃度的最大偏差為9.17%，在理論濃度的±20%以內(nèi)，實測濃度相對穩(wěn)定，因此采用理論濃度計算毒性端點值[8-9]。滅草松對穗狀狐尾藻毒性試驗的暴露濃度見表1。

表1 滅草松測定結(jié)果

2.2 穗狀狐尾藻毒性試驗結(jié)果

試驗結(jié)束后，分別以植物地上部分、根部和整株植物的長度，干重和鮮重作為測量變量，以平均生長率和生物量增長作為響應(yīng)變量，計算各處理組的抑制率。結(jié)果顯示，抑制率隨滅草松濃度的升高而升高，呈現(xiàn)出顯著的濃度-效應(yīng)關(guān)系。以地上部分作為測量變量，長度、鮮重和干重的ErC50值分別為有效濃度1.48、1.59和1.05 mg/L，EyC50值分別為有效濃度0.783、0.638和0.453 mg/L；以根部作為測量變量，長度、鮮重和干重的ErC50值分別為有效濃度1.85、1.08和1.22 mg/L，EyC50值分別為有效濃度1.250、0.441和0.435 mg/L；以整株植物作為測量變量，長度、鮮重和干重的ErC50值分別為有效濃度1.59、1.45和1.09 mg/L，EyC50值分別為有效濃度0.923、0.570和0.446 mg/L。滅草松對穗狀狐尾藻的毒性結(jié)果見表2、3。

表2 滅草松對穗花狐尾藻毒性結(jié)果（ErC50）

表3 滅草松對穗花狐尾藻毒性結(jié)果表（EyC50）

3 結(jié)果與討論

滅草松，3-異丙基-(1H)-苯并-2,1,3-噻二嗪-4-酮-2,2-二氧化物，分析檢測主要包括液相色譜法和氣相色譜法。Thomas等[10]采用梯度淋洗將制劑混雜物中的滅草松溶解出來，然后用液相色譜進(jìn)行測定。黃誠等[11]采用氣相色譜法測定水中的滅草松含量。筆者采用高效液相色譜法檢測試驗溶液中滅草松的實際含量，線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)為1.000 0，添加回收有效濃度為0.100和50.0 mg/L時，回收率范圍分別為101%～107%和101%～102%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.10%和0.108%。該方法科學(xué)靈敏，符合水樣中農(nóng)藥含量分析的要求。

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中滅草松因為具有防效好，殺草譜廣等特點而被廣泛上使用[12-13]。歐洲食品安全局（EFSA）數(shù)據(jù)[14]顯示，20℃條件下，pH值為7和9時，滅草松在水中溶解度分別為7.7 g/L和17 g/L；25℃條件下，pH值為5、7和9時，水解穩(wěn)定，即滅草松水中溶解度高，且在水中穩(wěn)定。本研究結(jié)果表明，滅草松對穗狀狐尾藻的根、莖和整株植物具有明顯的毒性效應(yīng)。因此，在使用過程中應(yīng)合理使用滅草松，避免對水生植物產(chǎn)生毒性影響。