繁殖期4種淡水魚類化學預警行為及其與性腺指數的關聯

夏繼剛,張 嬙,劉 香,張 寧

重慶師范大學生命科學學院, 重慶市動物生物學重點實驗室,進化生理與行為學實驗室,重慶 401331

化學通訊是水生動物最原始、最普遍和最主要的通訊方式之一[1-9]。與陸生動物相比,由于受到水環境透明度、濁度等生態因子的制約,魚類等水生動物的視覺通訊往往受到很大限制,依賴于嗅覺系統的化學通訊成為水生動物生存的必要選擇[4-8]。介導魚類通訊的化學信息主要包括性信息素和一般環境化學信息,其中性信息素主要與魚類的繁殖生理與繁殖活動有關,相關研究已日趨成熟；相較而言,食物或化學預警信息(Chemical alarm cues, CAC)則在魚類捕食者-獵物種間關系中起重要作用,主要與生存適合度密切關聯,近年來逐漸成為研究熱點[10-13]。CAC能夠引起同伴快速預警與反捕食響應,從而提高種群的整體適合度[2-3,6-10]。

在眾多的魚類化學預警信息中,魚體受到來自捕食者攻擊等外界的機械性損傷時由表皮棒狀細胞破損釋放的化學預警信息(Damage-released chemical alarm cues, DCAC)備受研究者關注。DCAC是一種次黃嘌呤-3-N-氧化物(Hypoxanthine-3-N-oxide)或一組功能相似的化合物,在實驗條件下相對比較穩定[14]。DCAC的表達與釋放無疑有助于提高魚類的反捕食能力,但魚類DCAC的產生及其行為應答本身是一種較為耗能的生理/生態過程[7,15-18]。值得注意的是,繁殖也是一種高能耗的生命活動[19-21]。因此,繁殖期魚類對DCAC是否依然保留或多大程度上保留對DCAC的響應便是一個有意義的問題。Smith等[22-23]少量研究者曾報道了繁殖期某些硬骨魚類DCAC的產生及其行為應答模式缺失并引起學界對繁殖期魚類化學預警通訊研究的回避[5,16]。

生態學家認為反捕食能力是動物適合度的基礎條件,適合度最大化必須同時依賴成功的生存和高效的繁衍。我們近期的一項研究發現,繁殖期高體鳑鲏(Rhodeusocellatus)依然對DCAC展現出一定程度的行為應答,并且其行為響應程度不受繁殖生理狀態和性別的影響[5],表明Smith等的研究結果并不具有普遍性。不過,考慮到高體鳑鲏繁殖生理投入很低,這種現象是否存在于其它不同繁殖投入(繁殖對策)魚類有必要進一步考證。為此,我們假定：(1)繁殖期魚類的化學預警通訊是否缺失與不同物種的繁殖生理投入有關,高繁殖投入的物種化學預警通訊可能弱化甚至缺失,而低繁殖投入的物種或將保留顯著的化學預警行為(假說一)；(2)個體對DCAC的應答程度同時受到環境風險強度(例如DCAC濃度)的影響和自身繁殖-預警能量分配的限制(假說二)。為驗證以上科學假說,本研究選取高體鳑鲏(卵生,繁殖投入較低)、斑馬魚(Daniorerio,卵生,繁殖投入較高)、孔雀魚(Poeciliareticulata,卵胎生,繁殖投入較高)和皮球魚(Poecilialatipinna,卵胎生,繁殖投入很高)4種淡水魚類為實驗對象(圖1),測定了繁殖IV期實驗魚對不同濃度DCAC的行為響應模式,并探究了4種實驗魚的化學預警響應與其性腺指數(Gonadosomatic index, GSI)的關聯。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗所用4種實驗魚種群均已在實驗室長期馴養。這4種魚均無親體撫育行為,在實驗室條件下也無尋覓適宜產卵生境或筑巢行為,因此繁殖生理投入基本上反映了繁殖投入總體狀況。為保證實驗馴養條件的一致性,實驗前,將所有實驗魚飼養于12個24 L的玻璃質循環水槽(40 cm×23 cm×42 cm,實際水深約26 cm；每種實驗魚設3個平行),并于實驗室條件下馴養適應2周。馴養期間,實驗用水為曝氣24 h以上的自來水,水溫(24±1)℃,溶解氧大于6.5 mg/L,光周期14 L∶10 D。每日早晚(09:00和20:00)以冰凍水絲蚓(Tubifexspp.)各飽足投喂1次,投喂15 min后,吸去殘餌及糞便并更換1/3水體。馴養結束后,選取健康活潑、大小相近且預估處于繁殖Ⅳ期的個體用于DCAC制備以及后來的行為學測試。繁殖Ⅳ的判斷以實驗測定結束后對性腺的解剖學特征為依據,非繁殖Ⅳ個體的相關測定不用于統計分析。

1.2 DCAC制備

將實驗魚鈍擊后斷頭處死,并在低溫條件下(冰上操作)迅速剝離身體兩側皮膚組織并精確計算出面積大小,然后將所剝離的皮膚組織放入研磨棒中加入適量冰水充分研磨使表皮細胞破碎、內容物流出,過濾,并最終配制成10 mL/cm2含有DCAC的母液。將各種實驗魚的DCAC母液分別及時分裝至若干10 mL的小袋中于-20℃冷凍保存,一周內用于實驗研究。根據前期實驗結果[5]和預實驗研究,繁殖期幾種實驗魚的DCAC是存在的。

1.3 實驗方案

對每種實驗魚均設置10 mL自來水(對照組)、2.5 mL DCAC+7.5 mL自來水(低濃度DCAC組)、10 mL DCAC(高濃度DCAC組)3個化學信息處理組,對應的濃度分別為0、0.025、0.1 cm2/mL的皮膚組織研磨液。實驗觀測設備為自制的方形水槽(60 cm×11 cm×36 cm,實際水深26 cm)。將單尾實驗魚轉移至實驗水槽,并給予20 min的適應期(依據預實驗研究結果,20 min后絕大多數實驗魚能夠適應實驗測試條件,恢復自發游泳狀態)。在此期間解凍DCAC和冰凍自來水。適應結束后,用攝像頭(Logitech Webcam Pro 9000,15幀/s)拍攝記錄實驗魚的行為響應,拍攝時間為5 min(Pretest)；之后,采用注射器分別將10 mL 的自來水或不同濃度的DCAC通過管道緩緩推入實驗水槽(操作時間為20 s并給予20 s的加樣操作恢復期)；接著繼續拍攝記錄5 min(Posttest)。實驗同時使用3個測試水槽(每個化學信息處理隨機使用1個),每做完1個重復,將所有實驗水槽沖洗3遍,確保無DCAC以及被試魚化學信息殘留。視頻錄制期間,水溫水質條件與馴養期間保持一致。

行為測試結束后,將每一條與行為測試相對應的實驗魚用MS-222麻醉后解剖,檢測其健康狀況及性腺成熟程度,用分析天平和直尺測定體重、體長、性腺重,并依據以上參數計算出性腺指數(GSI,GSI=m′/m× 100,式中m′、m分別為性腺重和體重)。本研究中,僅將體質健康并處于繁殖Ⅳ期的個體用于統計分析。各個化學信息處理組,高體鳑鲏、斑馬魚、孔雀魚和皮球魚被用于統計分析的樣本量分別為n=28、n=25、n=28、n=28。4種實驗魚的GSI差異顯著(圖1,表1)。

表1 4種實驗魚的形態參數與性腺指數

圖1 4種實驗魚的形態與性腺指數示意圖

1.4 數據分析

采用Noldus動物運動軌跡跟蹤軟件(EthoVision XT 9.0, Noldus, Netherlands)對所有錄制視頻進行分析。通過對實驗魚空間分布狀態(以底棲時間表征,即在距離實驗水槽底部5 cm范圍內出現的時間)、活躍狀態(以靜止時間、運動距離、運動平均速度和身體不重合度表征,其中靜止狀態的判斷標準為實驗魚的圖心位移小于1 cm/s)、逃逸行為(以高速運動時間表征,即運動速度大于30 cm/s的時間)的解析來量化實驗魚的化學預警響應[5,7,16]。為了消除行為背景值對DCAC效應的影響,將DCAC加入前后行為參數的變化量(Posttest-Pretest)用于統計分析[2]。

應用SPSS 19.0對數據進行統計分析。首先對實驗數據進行正態性和方差齊性檢驗。若數據滿足正態性和方差齊性,采用單因素協方差分析(以GSI為協變量)和Tukey′s HSD多重比較檢驗差異顯著性,Pearson相關分析檢測實驗魚行為響應變化與GSI的關聯；若數據不滿足正態性和方差齊性,采用Scheirer-Ray-Hare分析[24]檢驗差異顯著性,Spearman相關分析檢測實驗魚行為響應變化與GSI的關聯。數據均以平均值±標準誤表示,顯著性水平設在P<0.05。

2 結果

2.1 化學預警信息對4種實驗魚的行為響應的影響

DCAC對4種實驗魚的化學預警行為均有顯著影響,不同魚類對DCAC的行為應答不盡相同(表2,圖2)。總體上,DCAC導致實驗魚底棲時間和靜止時間增加(P<0.05)或有增加的趨勢、運動距離和身體不重合度減少(P<0.05)或有減少的趨勢。DCAC對運動平均速度無顯著影響(P>0.05),除孔雀魚外DCAC對高速運動時間也無顯著影響(P>0.05)。此外,高濃度和低濃度DCAC處理對除身體不重合度以外的行為參數均無顯著影響(P>0.05)。

圖2 化學預警信息對4種實驗魚的行為響應的影響

表2 化學信息和性腺指數對4種實驗魚的行為響應參數的影響

2.2 4種實驗魚化學預警響應與其GSI的關聯

除了高濃度DCAC處理組皮球魚的GSI與其底棲時間的變化顯著負相關(r=-0.405,P<0.05,表3),在其它處理組以及其它魚類中均未發現GSI與化學預警響應參數的變化有顯著的相關性(P>0.05,表3)。

表3 4種實驗魚化學預警響應與性腺指數的關聯

3 討論

化學預警通訊是魚類應對被捕食風險一種有效的生態策略,然而,魚類DCAC的產生及其行為應答本身是一種較為耗能的生理/生態過程[7,15-18]。在不同生活史階段或特定生理狀態下,魚類往往面臨基于能量供需的“覓食-避敵”、“生存-發育”等權衡(Trade-offs)。例如,Brown等[16]發現,黑頭呆魚(Pimephalespromelas)被饑餓48 h后對DCAC的行為應答缺失,而飽食組和短時饑餓組(12 h以內)的實驗魚卻展示出顯著的化學預警行為(包括增加的隱匿時間、增加的爆發游泳以及僵直行為等)；類似地,McCormick等[17]發現,來自被食物剝奪的星塘鱧(Asterropteryxsemipunctatus)的DCAC不能夠引發同種個體的化學預警響應,而來自飽食投喂組動物的DCAC卻能夠導致同種個體產生顯著的化學預警響應,提示食物剝奪或能量赤字將對魚類DCAC的產生以及行為應答造成不利影響。此外,發育早期的孔雀魚仔魚并不表現出對同生群個體CAC的行為應答,但發育14 d后的仔魚卻表現出顯著的行為回避響應,提示發育早期生長優先的策略可能更有益于種群適合度的提高[3]。

魚類進入繁殖狀態需要較高的能量成本,能量儲備被認為是雌性能否進入繁殖期的限制條件之一,只有貯存了足夠能量的個體才能進入繁殖狀態[19-21]。GSI通常被作為魚類繁殖生理投入的核心指標用于相關研究[19,25]。由于繁殖期增大的GSI往往導致魚體腹部顯著凸起,增加其運動能耗并限制其逃逸能力[26-27],因此,對環境風險信息的識別與應答就至關重要。鑒于繁殖期魚類的繁殖生理投入和化學預警響應均具有較高的能量需求,二者可能存在基于能量供需的生存-繁殖的權衡。那么,繁殖期魚類的化學預警行為表現到底如何呢？早期的一些研究者發現黑頭呆魚等一些硬骨魚類繁殖期DCAC的產生及其行為應答模式缺失。例如,繁殖期雄性黑頭呆魚產生DCAC的表皮棒狀細胞缺失,無法產生DCAC,但雌性仍可通過棒狀細胞產生[22]；繁殖期不同性別的曲口魚(Campostomaanomalum)產生DCAC的表皮棒狀細胞均大量缺失,無法產生足夠量的DCAC[23]；Pollock等[28]發現,黑頭呆魚對來自繁殖期和非繁殖期雌性個體的DCAC的行為響應無顯著差異,繁殖生理狀況與反捕食行為無統計學意義上顯著相關性,但與反捕食行為存在負相關趨勢[28]。本研究發現,DCAC對高體鳑鲏、斑馬魚、孔雀魚、皮球魚4種不同繁殖生理投入(繁殖對策)的實驗魚的化學預警行為均有顯著影響,具有最高繁殖投入的皮球魚的化學預警響應不僅沒有缺失而且沒有弱化,研究結果不支持“假說一”；不僅如此,除了高濃度DCAC處理組皮球魚的GSI與其底棲時間的變化呈現顯著負相關,在皮球魚的其它處理組以及其它魚類中均未發現GSI與化學預警響應參數的變化有顯著的相關性,結果提示高繁殖投入物種種內個體的化學預警響應可能存在繁殖投入-避敵表現的權衡,但這種權衡也僅在高風險環境下(例如高濃度DCAC)顯著存在,研究結果僅在少有的特定情況下支持“假說二”。

本研究回答了長期以來有關繁殖期魚類化學預警通訊是否缺失的問題。主要研究發現包括：(1)證實了繁殖期不同繁殖生理投入的4種淡水魚類均有顯著的化學預警響應；(2)揭示了魚類GSI與其化學預警響應程度的內在關聯(普遍不相關,僅在高風險環境下繁殖生理投入很高的物種中可能呈現負相關)。盡管DCAC對4種實驗魚的空間分布、活躍狀態、逃逸行為等大部分化學預警響應參數均有不同程度的影響,但不同魚類對DCAC的行為應答程度不盡相同。特別是,從圖2中靜止時間的變化、身體不重合度的變化等參數可以看出,隨GSI增加,化學預警響應程度有增大的趨勢。因此,在種間水平上,繁殖生理投入高的物種可能具有更為顯著的化學預警響應。在種內水平上,總體上,DCAC導致實驗魚靜止時間增加、運動距離和身體不重合度減少或有減少的趨勢。可見,運動狀態是指示幾種魚化學預警響應有效的行為參數。此外,不同行為參數對環境風險強度(DCAC濃度)的敏感性可能不同,高濃度和低濃度DCAC處理對高體鳑鲏和斑馬魚的身體不重合度有顯著影響,但對其它所測行為參數均無顯著影響,提示未來魚類化學預警行為研究中,對行為應答程度的分級是必要的。

本研究所涉及的4種實驗魚不僅繁殖生理投入差異顯著,而且繁殖對策也體現了多樣性(其中高體鳑鲏和斑馬魚為卵生,孔雀魚和皮球魚為卵胎生),研究結果具有一定的代表性,對于深入理解魚類繁殖與生存對策的權衡有一定的生態學意義,亦可望為行為生態學、保護與恢復生態學相關研究提供啟發。不過,考慮到繁殖期魚類的化學預警通訊可能受到多種內在調節機制和外界環境的影響,在與相關研究進行比較時,必須謹慎對待。首先,本研究所用實驗魚為來自實驗室馴養的較長期缺乏天然捕食者的種群,在與野生種群的相關研究進行比較時應格外注意[5,28]；其次,“個性”與魚類的化學預警響應有關并且可能掩蓋繁殖生理狀態的效應[4],進而影響化學預警行為與生理狀態的關聯；再次,本實驗所用幾種魚的繁殖行為相對較為溫和,然而某些魚類由于在繁殖期具有十分劇烈的筑巢、求偶、交配等行為而容易導致皮膚破損,對于那些魚類而言,其DCAC暫時性/季節性缺失則又是合理的,以避免給予配偶錯誤信號,有助于提高繁殖成功率[29-30]。