黃河三角洲濱海濕地微生物多樣性及其驅動因子

李金業,陳慶鋒,2,*,李 青,趙長盛,馮 優,李 磊

1 齊魯工業大學(山東省科學院)山東省分析測試中心, 濟南 250014 2 山東師范大學地理與環境學院, 濟南 250014

濱海濕地是陸地和海洋生態系統之間的過渡帶,具有生物多樣性高、生態敏感性強等特點[1]。微生物是濕地環境和有機物分解的重要組成部分,它可以改變濕地土壤的理化特性,在土壤有機質動態、能量傳遞和元素生化循環等方面起著重要作用[2]。同時,濕地微生物多樣性高對于土壤生態系統的穩定和服務功能的提高具有不容忽視的作用,將有助于提高微生物種群的遺傳多樣性[3],并對提高物質的營養循環和重要生態系統過程的效率有積極的影響[4]。近年來,濕地土壤微生物群落結構和功能的重要性越來越受到關注[5]。

黃河三角洲濱海濕地不僅是我國暖溫帶地區最年輕、最完整、面積最大的濕地之一[6],也是世界上陸地-海洋相互作用最活躍的區域之一,在濕地生物多樣性保護和水質凈化中發揮著重要作用[7]。由于圍墾、海岸侵蝕和石油污染等人為干擾,濱海濕地正經歷著持續而嚴重的退化,面積不斷減小[8]。微生物對環境變化非常敏感,這些破壞效應會影響濕地土壤微生物的群落組成。反過來,濕地土壤微生物的變化又會導致濕地生態系統的整體結構和功能發生變化[9]。濕地植物與土壤環境因子相互作用,對土壤微生物群落及功能多樣性產生影響[10]。濱海濕地土壤養分含量低、透氣性差,植物、土壤微生物多樣性均不高,尤其是原生鹽堿土壤中的微生物群落多樣性更低[11]。目前已有研究揭示了黃河三角洲濕地的植被格局分布,以及不同類型植被恢復對土壤性質和植被多樣性的影響[12-13]。濕地植物可以通過提供凋落物中的營養物質直接影響土壤微生物的功能[14],根際分泌物會改變氧化還原電位、pH值等根際環境,間接決定根際微生物種類和數量[15],植物根際鐵錳氧化膜與細菌群落結構也存在某種關聯。有關黃河三角洲濱海濕地微生物群落多樣性與植被關系的研究直到20世紀90年代才逐步開展[16-17],植物群落和環境因子對濕地土壤微生物影響的研究越來越得到關注。

本研究以黃河三角洲濱海濕地表層土壤和植物根際為研究對象,通過高通量測序技術對土壤和植物根際中的微生物進行了初步研究,旨在揭示植被根際微生物與土壤微生物的結構和豐度特征,分析微生物群落與土壤環境因子之間的內在關系,將為認識黃河三角洲濱海濕地的生物地球化學循環提供微生物生態學視角。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

本研究以黃河三角洲濱海濕地為研究對象,研究地點位于黃河三角洲的中心區域(117°31′—119°18′E,36°55′—38°16′N)。該地區位于渤海灣南岸和萊州灣西岸,屬于溫帶半濕潤大陸性季風氣候。研究區內主要為鹽漬型土壤,受潮汐海水入侵影響,土壤鹽漬化嚴重(高達70%),主要濕地植物為蘆葦、堿蓬和檉柳。

1.2 樣品采集

通過野外實地調研,2018年5月選取區域內代表性的翅堿蓬群落、蘆葦與檉柳灌木混合植被群落、灘涂裸地、油田等13個采樣點為調查對象進行采樣(圖1)。土壤樣品采樣時,首先去除土壤表層有機物和細根等雜質,然后按照5點取樣法用鐵鍬采集20 cm × 20 cm 樣方中表層(約0—25 cm)土樣,每個采樣點重復3次,共39個樣品。為了研究植物對土壤微生物種群的影響,選擇了4個優勢種,即蘆葦、檉柳、堿蓬和蒿,用鐵锨挖出植物,收集根際土壤,共采集9個根際土壤樣品(表1)。所有樣品儲存在采樣袋后,放在液氮中冷卻,然后送到實驗室。每個樣品分成兩部分：一部分樣品風干研磨后,分別過不同孔徑的篩子用于土壤理化性質測定；另一部分在-80℃的環境中冷凍保存,送到北京博奧晶典生物技術有限公司測序。

表1 土壤采樣點及生態系統狀況

圖1 黃河三角洲濕地監測點

1.3 土壤理化性質測定

1.4 土壤總DNA提取、PCR擴增及測序

選用 Fast DNA SPIN Kit for Soil 試劑盒提取土壤微生物基因總DNA,將提取得到的土壤DNA溶解于70 μL無菌TE緩沖液中,具體提取過程按照試劑盒說明書進行操作。電泳檢測后,對16S rRNA V3+V4(細菌)區域進行擴增,細菌引物[18]序列為：338F 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′及806R 5′-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′,使用Illumina Hiseq測序平臺,利用雙末端測序(Paired-End)的方法,構建小片段文庫進行16S rRNA測序。

1.5 數據分析

通過對Reads拼接過濾,OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類(97%),并進行物種注釋及豐度分析,揭示樣品的物種組成。通過α多樣性的五個指數,包括Coverage,Simpson,Chao1,ACE和Shannon指數分析樣本內的物種多樣性,進一步對β多樣性分析(Beta Diversity)和顯著物種差異進行分析,挖掘樣品之間的差異。本研究選擇UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean)分析物種組成相似度。

使用Microsoft Excel和Adobe Illustrator 16.0(Adobe Systems Inc., San Jose, USA)進行數據統計和繪制圖形。通過Alpha多樣性分析,統計了各樣品的覆蓋度、Ace指數、Chao1指數和shannon指數。使用QIIME軟件進行β多樣性分析來評估樣品在物種復雜性方面的差異。利用SPSS19.0(International Business Machines Corporation, Armonk, USA)軟件,采用主成分分析(PCA)和相關分析(CA)分析土壤理化性質間的關系,顯著性差異定義為P<0.05。采用Canoco 5.0(Microcomputer Power, New York, USA)軟件分析土壤理化性質與土壤細菌群落多樣性之間的關系,識別影響濕地群落結構的主導因子。

2 結果與分析

2.1 土壤和根際微生物樣品測序結果

通過雙末端測序(Paired-End)并優化后,13個土樣共獲得853672條有效序列(Effective Tags),Effective Tags平均長度集中在411—421 bp之間,占PE Reads序列的86.28%,質量值≥30的堿基約占總堿基數的95.5%—96.08%。序列的長度和數量是將序列匹配到數據庫從而產生基因注釋的關鍵,保證了微生物物種多樣性分析的科學性、真實性。13個土樣中的微生物歸屬于27門、54綱、143目、282科、627屬和705種,微生物多樣性指數和覆蓋率見表2。從表2可以看出,蘆葦檉柳區(HW4-2)的OTU數最多,高于其他地區。微生物豐富度指數(Chao 1指數和ACE指數)表明蘆葦檉柳生長區的微生物豐度高于灘涂裸地(HW1-1、YWS2和YWS6)、堿蓬區(HW6-1、YWS3)和棉田區(HW5-1),海漫灘(YWS2)中微生物豐度明顯高于河漫灘(YWS6)和泥灘(HW1-1)。

香農指數(Shannon index)是反映樣本微生物多樣性的另一種表現形式,從圖2和表2可以看出土壤樣品中細菌的香農指數大約在4—5.5之間,而根際細菌香農指數范圍約為0—4,說明土壤細菌群落結構和多樣性均明顯大于植物根際細菌。根際中OTU豐富度的下降歸因于根際過程的均質化作用,從而減少了生態位。

圖2 樣品香農指數曲線

表2 微生物的多樣性指數及覆蓋率

2.2 微生物群落結構組成分析

在所有濕地土壤樣本中,土壤微生物表現出較高的多樣性(圖3)。樣本的門水平分類中豐度前十的物種組成基本一致,主要包括變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、藍藻菌門(Cyanobacteri)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes),其中,細菌分布以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門為主,這四種細菌門在各樣本中合計占比高于90%,這可能表明了它們在濕地中的穩定性,這與之前變形桿菌門在黃河口數量最多的研究結果[19-20]不同。與土壤微生物相比,根際微生物的優勢菌群發生了變化(圖3),以藍藻門細菌為主,豐度較高的菌群還有變形菌門、放線菌門和厚壁菌門,和占比約為總菌群的90%,特有的細菌為Patescibacteria。

圖3 樣品中細菌群落門水平上的相對豐度

圖4為基于Beta多樣性分析得到的UPGMA聚類樹與屬水平上細菌豐度的結合圖。在聚類樹中,樣品越靠近,枝長越短,表示兩個樣品的物種組成越相似。在土壤細菌群落結構中,YWS3和HW5-1與其他采樣點細菌結構差異性最大,YWS3中的細菌豐度排名前10的物種較少,HW5-1以Coffea_arabica_coffee為主。HW1-1與YWS2物種組成相似,但與YWS6物種組成相似性較遠。油井附近采樣點微生物結構也不同,YWS1細菌分布均勻,而Uncultured_bacterium_f_muribaculaceae在YWS5中豐度較高。豐度檢測前10的屬包括Lactobacillus(乳酸菌屬)、Uncultured_bacterium_f_muribaculaceae、Rhodococcus(紅球菌屬)、Bifidobacterium(雙歧桿菌屬)、Coffea_arabica(咖啡屬)、Thauera(索氏菌屬)、Ruminococcus(瘤胃球菌屬)、Ochrobactrum(蒼白桿菌屬)、Flavobacterium(黃桿菌屬)、Escherichia_Shigella(埃希氏桿菌屬),主要是屬于厚壁菌門和酸桿菌門。植物根際細菌中,HW3-15P1與HW2-15P1的種群結構相似,以Lolium_perenne為主,而其他根際細菌結構以Coffea_arabica_coffee為主。豐度檢測前10的屬主要包括Coffea_arabica_coffee、Lolium_perenne、Pseudoalteromonas(假交替單胞菌屬)、Oryza_meyeriana、Vibrio(弧菌屬)、Streptomyces(鏈霉菌屬)、Photobacterium(發光桿菌屬)、Pseudomonas(假單胞菌屬)、Marinomonas(海單胞菌屬),主要是屬于藍藻門、變形菌門和放線菌門。

圖4 屬水平上UPGMA聚類樹與柱狀圖組合圖

黃河三角洲濕地微生物豐度和結構的差異性主要表現在同一生境類型不同采樣點間微生物物種差異、不同生境類型下微生物物種差異及同一采樣點植物根系與土壤中微生物的差異。HW1-1、YWS2、YWS6為漫灘地,有少數植被覆蓋,細菌門水平上的豐度大小順序依次為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、藍藻門,YWS5為油田附近灘涂,其細菌豐度依次為擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、厚壁菌門和藍藻門。檉柳區(HW4-1、YWS4)與植被混合區(HW2-1、HW3-1、HW4-2)菌門豐度相近,依次為厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和藍藻門；翅堿蓬覆蓋區的優勢菌群豐度差異較大,翅堿蓬(YWS3)中變形菌門和擬桿菌門的豐度高于HW6-1,厚壁菌門、放線菌門和藍藻門的豐度則低于HW6-1；棉田(HW5-1)以藍藻菌門的產氧光細菌綱為主,次優勢類群為厚壁菌門、變形菌門和放線菌門,這一現象與植物根系的菌群結構極其相似。

2.3 土壤環境因子與土壤微生物群落結構的相關性分析

2.3.1土壤環境影響因子及其相關性分析

表3 不同土壤的主要環境參數

2.3.2土壤環境因子與微生物群落多樣性的相關性分析

表4 土壤環境因素的相關系數矩陣

表5 土樣的主成分分析和因子載荷

圖5 門和屬水平細菌群落結構與環境變量的RDA排序圖

3 討論

3.1 土壤和根際微生物群落結構特征

濕地土壤具有較厚的有機質層,其溫度和氧含量比其他類型的土壤更穩定,使得濕地細菌群落具有相對穩定的組成以保證其生態功能,這就解釋了不同類型的濕地土壤中菌群結構的相似性[23]。在門和屬水平上,微生物群落存在差異,土壤中細菌以變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門為主,但在不同類群中仍存在明顯的類群豐度差異,如HW5-1中藍藻菌門的豐度較高,YWS3中變形菌門的豐度較高,YWS5中擬桿菌門的豐度較高。同時,細菌的豐度和結構還受到植被的影響,植物多樣性可以用來預測土壤微生物群落的多樣性。黃河三角洲典型的蘆葦區、檉柳區、堿蓬區及漫灘裸地中菌群豐度表現出明顯的差異。根際中豐度較高的細菌包括藍藻門、變形菌門和放線菌門,其中藍藻門的平均豐度達到50%以上。

3.2 微生物群落與環境因子的相關性

4 結論

本研究利用高通量測序技術研究了我國黃河三角洲濱海濕地土壤和植物根際細菌群落的豐度和結構,揭示了環境因子與濕地土壤中微生物群落結構組成的內在聯系,主要結論如下：

(1)濕地土壤和植物根際中優勢菌群結構存在差異。土壤細菌分布以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門為主,在各樣本中合計占比高于90%；根際細菌豐度較高的為藍藻門、變形菌門、放線菌門和厚壁菌門,土壤微生物的豐度和多樣性顯著大于根際細菌,在屬水平上土壤和植物菌群結構的差異更明顯。

(2)裸地、蘆葦、檉柳和堿蓬等不同生境類型條件下細菌的物種組成存在差異。微生物豐富度指數表明蘆葦檉柳生長區的微生物豐度高于灘涂裸地、堿蓬區和棉田區,海漫灘中微生物豐度明顯高于河漫灘和泥灘。

本研究有助于了解黃河三角洲濱海濕地土壤和植物根際的細菌分布特征,研究微生物不同功能之間存在的內在聯系,維護三角洲濕地生態系統穩定性、生物多樣性和遺傳多樣性。