MicroRNA-150水平與原發性肝癌手術預后的關系*

吳娜娜，陳星宇，姚輝華，王忠福

（成都市第一人民醫院1.腫瘤二科，2.胃腸疝外科，3.介入血管外科，四川成都610041）

原發性肝癌（primary hepatocellular carcinoma,PHC）惡性程度高，發病隱匿，大部分患者確診時已處于中晚期，且有肝內外轉移，即便接受腫瘤切除術，患者術后5年生存率僅有24%～50%[1-3]。目前臨床針對PHC 高危人群的篩查主要依賴于超聲檢查及甲胎蛋白（alpha-fetoprotein, AFP），但超聲檢查很難發現微小病灶，且PHC 患者中AFP 輕度升高或呈陰性占比高達20%～40%，存在一定的漏診率[4-5]。因此，挖掘新的PHC 預后分子標志物，探討新型防治靶點及侵襲轉移分子機制，對延長患者生命具有指導性意見。PHC 的發生、發展屬于一個多步驟、多階段過程，每個階段均有著不同的細胞信號傳導通路異常、癌基因及抑癌基因失衡、細胞周期調節改變等，而miRNA 可作為抑癌基因或癌基因影響細胞凋亡、增殖、遷移等腫瘤相關通路，進而調控腫瘤諸多生物學行為[6-7]。miR-150 是定位于19q13.33的單鏈miRNA，長度為2 nt，近年來不斷有研究發現，miR-150 在系統性硬化病、惡性腫瘤、組織纖維化、肺動脈高壓等多種疾病中異常表達[8]。有研究發現，肝癌患者血清miR-150 水平下調，其水平與患者病理學特征密切相關，但尚不清楚miR-150與肝癌患者預后的關系[9]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月—2018年1月在成都市第一人民醫院接受手術治療的PHC 患者80 例作為PHC 組。其中，男性52 例，女性28 例；年齡45～79 歲，平均（63.02±5.11）歲；體重指數（body mass index, BMI）18.5～24.6 kg/m2，平均（21.59±2.24）kg/m2。納入標準：①符合《原發性肝癌規范化病理診斷指南（2015年版）》[10]中PHC診斷標準；②Child-Pugh分級A級、B級；③檢測前未接受放療、化療及射頻消融等治療；④首次接受腫瘤切除術，無手術禁忌證。排除標準：①活動性肝炎；②藥物或酒精性肝損傷；③既往接受肝移植或肝膽手術；④腫瘤保留不完整、邊界模糊；⑤凝血功能異常；⑤伴有自身免疫疾病、其他腫瘤或精神疾病。另選取同期本院健康體檢者80 例作為對照組。其中，男性49例，女性31例；年齡42～80歲，平均（62.94±4.86）歲；BMI 18.95～25.2 kg/m2，平均（22.03±2.15）kg/m2。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者及家屬自愿簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

Trizol Reagent 試劑盒（德國凱杰公司），TapMan MicroRNA RT 試劑盒（美國ABI 公司），miR 特異性TapMan 探針及TapMan Universal PCR Master Mix（美國ABI 公司）。

1.3 方法

采集PHC 組術前、術后3 d 及對照組體檢當日的5 ml 空腹靜脈血，置于含有EDTA 抗凝試管中，室溫下靜置1 h，3 000 r/min 離心10 min，取上清液于干凈離心管中，置入-80℃冰箱冷凍保存。使用Trizol Reagent 試劑盒提取血清中總RNA，通過TapMan MicroRNA RT 試劑盒將RNA 逆轉錄成cDNA，具體操作參照說明書。使用miR 特異性TapMan 探針及TapMan Universal PCR Master Mix 進行miR-150 的qRT-PCR 檢測，U6作為內參基因，其正向序列：5'-GGTATGATGCAGTAGCACC-3'，反向序列 ：5'-AAGTGATCGCAGTACGTAC-3'，長度分別為121 bp、119 bp；miR-150 正向序列：5'-GTGTATGCAGCAGT AGCTGGA-3'，反向序列：5'-CAGTAGTCAGTACGGA CGAAG-3'，長度分別為116 bp、118 bp。總反應體系為20 μl，qRT-PCR 反應條件：50℃預變性2 min，95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，共循環40 次。根據2-ΔΔCt法計算miR-150 相對表達量。電話隨訪時間截止至2021年2月，統計PHC 患者術后1年和術后3年生存率。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 23.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；計數資料以構成比表示，比較用χ2檢驗；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗，影響因素的分析用多因素Cox 風險比例模型。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者手術前后血清miR-150相對表達量比較

對照組、PHC組患者術前血清miR-150相對表達量分別為（0.93±0.15）和（0.42±0.09），經t檢驗，差異有統計學意義（t=26.077，P=0.000），PHC組較對照組低。PHC組術后血清miR-150相對表達量為（0.73±0.12），與術前miR-150相對表達量比較，差異有統計學意義（t=18.485，P=0.000），術后較術前高。

2.2 不同血清miR-150水平患者的臨床病理特征比較

以miR-150 相對表達量0.42 作為分界值，將PHC組分為高表達組和低表達組，分別有48和32例。兩組患者不同組織分化程度、不同TNM 分期、是否伴有肝硬化及是否伴有轉移比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。兩組患者性別比、不同年齡、不同腫瘤直徑、是否伴有肝硬化復發、是否伴有乙型肝炎、不同AFP 水平、是否伴有門脈癌栓比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組患者臨床病理特征比較 例

2.3 血清miR-150水平與PHC患者預后的關系

高表達組與低表達組患者3年累積生存率分別為62.50%和21.88%，經Log-rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=15.946，P=0.000），低表達組較高表達組低。低表達組、高表達組中位生存時間分別為19.4 個月、29.0 個月。見圖1。

圖1 高表達組和低表達組患者的生存曲線

2.4 影響PHC患者3年生存率的Cox回歸分析

單因素、多因素Cox 回歸模型分析結果顯示，miR-150 低表達、腫瘤直徑≥5 cm、TNM 分期Ⅲ期和Ⅳ期、肝硬化、轉移、AFP ≥25 ng/ml 及伴有門脈癌栓是影響PHC 患者3年生存率的獨立因素（P＜0.05）。見表2、3。

表2 影響PHC患者3年生存率的單因素Cox回歸分析參數

表3 影響PHC患者3年生存率的多因素Cox回歸分析參數

續表3

3 討論

目前，臨床關于PHC 的具體發病機制尚未完全闡明，但多認為與乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染、吸煙、環境污染等因素相關[11]。現代研究表明，腫瘤的發生、發展屬于分子調控失控過程，涉及諸多環節，包括抑癌基因失活、癌基因激活、細胞基質間黏附障礙及細胞信號傳導異常等[12]。但對PHC的病理、生理認知仍存在一定不足，深入分析其發病機制及防治靶點，尤其是借助測序技術、分子生物學等手段探索評估預后的新型標志物，對改善PHC 預后尤為重要。

miRNA 屬于一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA，由22 個核苷酸構成，長度18～25 nt，其與下游多個靶基因結合后可抑制、降解轉錄后基因水平，調節靶基因蛋白和mRNA 表達，進而調控細胞細胞分化、凋亡及增殖的諸多生物學特性，同時參與調控腫瘤干細胞、調節腫瘤微生物及腫瘤的遷移、侵襲等過程[13]。ZHANG 等[14]研究發現，miR-150 在結直腸癌組織中低表達，且可能通過抑制高遷移率族蛋白A2阻斷細胞增殖，下調Cyclin A表達阻滯細胞周期。JIANG 等[15]研究報道，miR-150 在非小細胞肺癌細胞中顯著上調，其可能通過SIRT2/JMJD2A 信號通路對細胞活力及遷移產生調節作用。喬恩奇等[16]研究發現，miR-150在乳腺癌中高表達，干擾miR-150表達可促進細胞凋亡及抑制細胞增殖，其作用機制可能與調控PI3K/Akt 信號、上調Leaved Caspase 等有關。以上研究證實，miR-150 在不同環境及疾病中可發揮一定的抑癌或促癌因子作用，但其在PHC 中是否發揮同樣作用及具體的機制尚未完全闡明。ZHANG 等[17]研究發現，miR-150 在原發性肝細胞癌中呈低表達，且可能通過下調靶標c-Myb 參與肝臟干細胞自我更新。YU 等[18]研究報道，肝細胞癌患者血清miR-150水平比健康對照者低，術后miR-150水平升高，腫瘤復發后降低，診斷慢性乙型肝炎病毒感染相關肝細胞癌的AUC 為0.931，敏感性為82.5%，特異性為83.7%，Kaplan-Meier曲線分析顯示，miR-150水平較低的患者總生存期更短。

本研究結果發現，miR-150 表達可能與PHC 患者組織分化程度、TNM 分期、是否伴有肝硬化及轉移相關，提示miR-150 水平與PHC 患者發生、發展關系密切，miR-150高表達可能對抑制癌轉移、減輕病情有一定作用。其原因可能在于miR-150過表達可能抑制癌細胞血管生成及轉移能力，而下調miR-150表達可加速腫瘤細胞轉移、侵襲，增強腫瘤血管生成能力，故miR-150 在PHC 患者中發揮抑癌作用。多因素Cox 回歸模型分析發現，miR-150 低表達、腫瘤直徑≥5 cm、TNM 分期為Ⅲ期和Ⅳ期、肝硬化、轉移、高AFP水平及伴有門脈癌栓是影響PHC患者3年生存率的獨立因素。

綜上所述，miR-150 在PHC 患者中低表達，與患者預后、組織分化程度、TNM 分期等關系密切，有望成為評估PHC 患者預后的新型分子標志物。但因本研究存在觀察時間短、樣本量少、樣本來源單一等局限性，有待延長觀察時間、擴大樣本量及范圍進一步探討。