宮頸脫落細胞microRNA-508-3p、ROCK1的表達及其對宮頸癌的診斷價值研究*

何立群，袁婧，張舒云

（諸暨市人民醫院病理科，浙江諸暨311800）

宮頸癌是全球女性第4 大常見癌癥[1]。早期發現可顯著降低宮頸癌患者治療難度，延長生存時間[2]。上個世紀，以細胞學為基礎的宮頸篩查在降低宮頸癌發病率和病死率方面取得了較大成功[3]。目前，宮頸脫落細胞學檢查是臨床常用的篩查宮頸癌危險人群的方法之一，特異性較高[4]。

MicroRNA（miRNAs）作為重要的基因調節因子，參與多種細胞內通路的調節[5]。而通過檢測宮頸脫落細胞miRNAs 的表達來評估宮頸癌的相關報道較少。有研究發現，microRNA-508-3p（miR-508-3p）上調對宮頸癌細胞的形成及肺轉移有抑制作用，miR-508-3p 在宮頸癌中發揮抑癌基因作用[6]。基礎研究證實ROCK1 與宮頸癌細胞的增殖及侵襲有關[7]。為進一步明確miR-508-3p、ROCK1 在宮頸癌中的表達及其診斷價值，本研究檢測宮頸脫落細胞（正常、宮頸上皮內瘤、宮頸癌）miR-508-3p、ROCK1 的表達水平，對兩者的相關性、靶向關系進行探討，并分析其與宮頸癌病理特征的關系，評估其對宮頸癌的診斷價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年2月-2019年9月諸暨市人民醫院收集的宮頸脫落細胞標本172 例。其中正常組（病理檢查正常）70 例，年齡32～60 歲；宮頸上皮內瘤變組（病理學檢查為宮頸上皮內瘤變[8]）54 例，年齡34～57 歲；宮頸癌組（病理學檢查為宮頸癌[8]）48 例，年齡31～55 歲。本研究經醫院醫學倫理委員會審批，所有受試者自愿參與實驗且配合度較好。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準通過宮頸脫落細胞學檢查，宮頸上皮內瘤變及宮頸癌患者符合相關診斷標準[8]；宮頸癌患者實施手術治療；臨床資料完整[包括年齡、絕經情況、腫瘤直徑、宮頸癌的國際婦產科聯盟 （International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期、淋巴結轉移、病理類型]。

1.2.2 排除標準術前行放化療、宮頸手術及子宮切除等治療；宮頸不完整；患其他惡性腫瘤；年齡＜30 歲，或＞65 歲；孕婦或妊娠期女性；生殖道炎癥性疾病[9]。

1.3 主要儀器與試劑

Trizol、PrimeScript RT 試劑盒、RNA 酶抑制劑由丹麥DAKO 公司提供，免疫顯色試劑miR-508-3p、ROCK1、U6、GAPDH 引物由上海生工生物工程股份有限公司設計，離心機由上海精密儀器儀表有限公司提供，酶標儀由上海沃元科技有限公司提供，實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR） 儀由杭州艾康生物技術有限公司提供，免疫組織化學試劑盒購自瑞士羅氏公司，ROCK1、GAPDH 相關抗體購自美國圣克魯斯生物技術公司。

1.4 qRT-PCR

提取總RNA。將收集的全部宮頸脫落細胞標本保存于含細胞保存液的離心管中，離心棄上清液，加入Trizol 溶液，用移液槍反復吹打后轉移至滅菌管中，放置10 min，加入0.2 ml 氯仿，混勻后冰上靜置30 min，離心棄上清液，再轉移至滅菌管中，加入等量的異丙醇，混勻后冰上靜置15 min，離心棄上清液，加入75%乙醇焦碳酸二乙酯水溶液1 ml，混勻后離心棄上清液，倒置在吸水紙上吸干，加入10 μl DEPC 水溶液，冰上靜置30 min 使RNA 充分溶解，或置入-80℃冰箱冷凍保存待用。再采用StemloopRT 法（反應體系：PrimeScript RT enzyme 0.8 μl，PrimeScript RT Buffer 2.0 μl，RNA 酶抑制劑0.2 μl，各基因RT 引物0.2 μl）在PCR 儀中進行逆轉錄，合成cDNA。反應條件：16℃、30 min，42℃、30 min，85℃、5 min，4℃持續。qRT-PCR 反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共計40 個循環。其中miR-508-3p 以U6 為內參，ROCK1以GAPDH 為內參。采用2-ΔΔCt法計算mRNA 相對表達量，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 免疫組織化學

將收集的宮頸脫落細胞標本制成細胞薄片，通過免疫組織化學鏈霉素抗生物-過氧化物酶法檢測ROCK1 蛋白。ROCK1 蛋白免疫組織化學陽性判定標準：ROCK1 蛋白在細胞質或細胞核中呈黃色或棕黃色表達。ROCK1 蛋白陽性表達率（%）=ROCK1 陽性細胞/全部脫落細胞×100%。

1.6 Western blotting

提取各標本中總蛋白，將提取出的蛋白100℃煮沸5 min，10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，轉膜，5%牛血清白蛋白室溫密封1 h，加入一抗（1∶1 000 稀釋）ROCK1 及GAPDH 4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液沖洗，加入相應二抗，室溫孵育1 h，顯色，暗室曝光，采用ImageJ 2x 軟件分析灰度值。

1.7 熒光素酶報告實驗

通過http：//www.targetscan.org 網站預測miR-508-3p 和ROCK1 的靶向關系，以及miR-508-3p 與ROCK1 3'-UTR 的結合位點。合成含miR-508-3p 結合位點的ROCK1 3'-UTR 啟動子區序列，構建ROCK1 3'-UTR 野生型（wild type, WT）質粒（ROCK1-WT）。并在該質粒基礎上構建ROCK1 3'-UTR 突變型（mutant type, MUT）質粒（ROCK1-MUT）。參照質粒提取試劑盒說明書進行操作。將ROCK1-WT、ROCK1-MUT 質粒分別與mimics NC、miR-508-3p mimics 質粒混勻后共轉染。轉染48 h 后通過熒光素酶試劑盒測定熒光素酶活性。

1.8 臨床病理資料分析

查閱并統計行宮頸癌手術患者的年齡、絕經情況、腫瘤直徑、FIGO 分期、淋巴結轉移、病理類型（鱗癌及腺癌）。參照miR-508-3p 及ROCK1中位值將宮頸癌患者分為高表達組與低表達組，對上述兩種基因與宮頸癌病理特征的關系進行分析。全部宮頸癌患者隨訪1年，統計其生存、死亡例數。

1.9 統計學方法

數據分析采用SPSS 24.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，方差分析的兩兩比較用SNK- q法；計數資料以構成比（%）表示，比較用χ2檢驗；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線；相關性分析用Pearson 法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞miR-508-3p及ROCK1的表達

正常組、宮頸上皮內瘤變組、宮頸癌組脫落細胞miR-508-3p、ROCK1 mRNA、ROCK1 mRNA 陽性率、ROCK1 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較：與正常組比較，宮頸癌組和宮頸上皮內瘤變組miR-508-3p 降低（P＜0.05），ROCK1 mRNA、ROCK1 mRNA 陽性率、ROCK1 蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與宮頸上皮內瘤變組比較，宮頸癌組miR-508-3p 降低（P＜0.05），ROCK1 mRNA、ROCK1 mRNA 陽性率、ROCK1 蛋白相對表達量升高（P＜0.05）。見表2和圖1、2。

表2 各組宮頸脫落細胞miR-508-3p、ROCK1比較

圖1 各組宮頸脫落細胞中ROCK1的表達 （免疫組織化學×200）

圖2 各組宮頸脫落細胞ROCK1蛋白的表達

宮頸癌組、宮頸上皮內瘤變組miR-508-3p 與ROCK1 mRNA 均呈負相關（r=-0.6678 和-0.5234，均P=0.000）。見圖3、4。

圖3 宮頸癌組miR-508-3p與ROCK1 mRNA的相關性散點圖

圖4 宮頸上皮內瘤變組miR-508-3p與ROCK1 mRNA的相關性散點圖

ROCK1是miR-508-3p 的預測靶基因（見圖5）。ROCK1-WT 中，miR-508-3p mimics 組與mimics NC組熒光素酶活性分別為（0.47±0.02）和（0.99±0.05），經t檢驗，差異有統計學意義（t=16.724，P=0.000），miR-508-3p mimics 組較低。ROCK1-MUT中，miR-508-3p mimics 組與mimics NC 組熒光素酶活性分別為（1.01±0.03）和（0.97±0.01），經t檢驗，差異無統計學意義（t=2.190，P=0.093）。

圖5 Targetscan網站預測miR-508-3p與ROCK1的靶向關系

2.2 miR-508-3p、ROCK1 表達與宮頸癌臨床病理特征的關系

不同FIGO 分期、有無淋巴結轉移患者的miR-508-3、ROCK1 表達水平比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05）；而不同年齡、絕經情況、腫瘤直徑、病理類型患者的miR-508-3p、ROCK1 表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各臨床病理特征宮頸癌患者miR-508-3p和ROCK1表達水平比較 [n=24，例（%）]

2.3 miR-508-3p、ROCK1 診斷宮頸癌和宮頸上皮內瘤變的ROC曲線

miR-508-3p 診斷宮頸癌的ROC 曲線下面積（area under curve, AUC）為0.946，敏感性為87.1%，特異性為100.0%，約登指數為0.871。miR-508-3p診斷宮頸上皮內瘤變的AUC 為0.851，敏感性為84.3%，特異性為79.6%，約登指數為0.639。見表4和圖6。

ROCK1 診斷宮頸癌的AUC 為0.949，敏感性為89.6%，特異性為100.0%，約登指數為0.896。ROCK1診斷宮頸上皮內瘤變的AUC 為0.905，敏感性為77.8%，特異性為88.6%，約登指數為0.663。見表4和圖6。

圖6 miR-508-3p、ROCK1診斷宮頸癌和宮頸上皮內瘤變的ROC曲線

表4 miR-508-3p、ROCK1診斷宮頸癌和宮頸上皮內瘤變的ROC曲線參數

2.4 生存組和死亡組脫落細胞miR-508-3p、ROCK1的表達

隨訪1年后，48 例宮頸癌患者中生存42 例，死亡6 例。生存組與死亡組miR-508-3p 和ROCK1 mRNA 相對表達量比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），生存組miR-508-3p 高于死亡組，ROCK1 mRNA 相對表達量低于死亡組。見表5。

表5 生存組與死亡組脫落細胞miR-508-3p、ROCK1 mRNA相對表達量比較

3 討論

約90%宮頸癌死亡患者處于低收入和中等收入國家，特別是在艾滋病流行率較高的地區，這主要是由于預防、篩查機會及治療選擇有限[10]。目前僅憑細胞形態學改變作為診斷依據難以滿足大面積宮頸癌篩查的需求[11]。隨著基因篩查、分子生物學、蛋白組學等生物醫學工程的不斷發展，宮頸癌標志物的篩選及其靶向治療的探索已成為臨床研究的焦點[12]。

miRNAs 是一類小分子非編碼RNA 序列，參與多種重要的生物學行為，在多種惡性腫瘤中均有miRNA 異常表達[13-16]。miR-508-3p是一種抑癌基因，在大腸癌[17]、乳腺癌[18]及胃癌[19]中呈低表達，上調miR-508-3p 可對腫瘤細胞的侵襲、轉移、凋亡及增殖發揮調控作用，可作為腫瘤性疾病的潛在治療靶點。HU 等[6]研究報道，miR-508-3p 在宮頸癌細胞和細胞系中呈異常低表達，其高表達可抑制宮頸癌細胞的增殖、侵襲和遷移，促進宮頸癌細胞凋亡。ROCK1 作為Rho 家族成員，可通過Rho/ROCK 信號通路激活反向相關信號分子，參與癌細胞的增殖、侵襲及轉移過程。在腫瘤的發生、發展中，ROCK1 可結合活化的Rho 蛋白，促使ROCK1 催化活性中心，誘導癌細胞肌動蛋白骨架重組，從而增強癌細胞運動能力[20]。現階段關于miR-508-3p、ROCK1 與宮頸癌關系的研究多集中于病變組織檢測或血清檢查，而miR-508-3p、ROCK1 在宮頸脫落細胞中的檢測尚未見研究報道。

自巴氏以形態學為基礎創立的涂片宮頸脫落細胞學檢查被應用于宮頸癌的篩查，宮頸癌患病率及病死率明顯降低[21]。有研究發現，血清[22]、唾液[23]及尿液[24]等樣本中能檢測到miRNAs。相較于血清標本，宮頸脫落細胞miRNA 的表達更具有特異性。因此本研究通過檢測健康人群、宮頸上皮內瘤變及宮頸癌患者宮頸脫落細胞miR-508-3p、ROCK1 的表達，分析兩者與宮頸癌臨床病理特征及預后的關系。

本研究結果顯示，miR-508-3p 相對表達量在正常組、宮頸上皮內瘤變組及宮頸癌組中依次遞減，說明當miR-508-3p 呈低表達趨勢時，宮頸病變越嚴重，而ROCK1 表達與之相反，同時暗示兩者存在一定的負調控關系。相關性分析結果顯示，宮頸癌組、宮頸上皮內瘤變組miR-508-3p 與ROCK1 mRNA 均呈負相關，推測miR-508-3p 可能通過靶向負調控ROCK1 的表達，參與宮頸病變的發生、發展。熒光素酶報告實驗結果表明，miR-508-3p 可能通過介導ROCK1 的表達來調節宮頸癌細胞的惡性生物學行為，進而對宮頸癌的發生、發展起到一定的調控作用，而關于兩者與宮頸癌細胞生物學行為作用機制的研究有待進一步探討。

本研究結果顯示，miR-508-3p、ROCK1 表達水平與宮頸癌患者的FIGO 分期、淋巴結轉移有關，而與年齡、絕經情況、腫瘤直徑及病理類型無關。提示宮頸癌患者宮頸脫落細胞miR-508-3p 表達水平越低，ROCK1 表達水平越高時，患者病情惡化越嚴重。這對宮頸癌的早期診斷具有一定的輔助意義。ROC 曲線結果顯示，miR-508-3p 和ROCK1診斷宮頸癌的AUC 分別為0.946 和0.949；miR-508-3p 和ROCK1 診斷宮頸上皮內瘤變的AUC 分別為0.851 和0.905，說明兩者在宮頸癌的篩查中具有較好的診斷價值。隨訪1年后，生存組miR-508-3p高于死亡組，ROCK1 mRNA 相對表達量低于死亡組，說明兩者對預后有預測作用。

綜上所述，宮頸脫落細胞miR-508-3p、ROCK1 在宮頸癌患者中表達異常，其中miR-508-3p 下調，ROCK1 上調，兩者呈靶向負調控關系，并與宮頸癌患者FIGO 分期及淋巴結轉移密切相關，具有一定的宮頸癌診斷價值，可作為早期宮頸癌篩查的潛在生物學指標。