趨化因子CCL2對老年ST抬高型心肌梗死患者殘余血小板活化的影響

曹禹，張慧慧，張桓，付營，李春輝，喬銳

北部戰區總醫院干部病房一科，沈陽 110016

急性心肌梗死(AMI)是冠心病中最危重的類型，也是心血管疾病致死的頭號殺手[1]。AMI是在冠脈粥樣硬化不穩定斑塊破裂的基礎上繼發了血栓形成，導致冠脈閉塞引起心肌壞死。血小板聚集和激活功能的改變在斑塊形成及斑塊破裂形成血栓過程中具有重要作用[2]。臨床上常用的抗血小板藥物多數為單靶點藥物，服用后仍能通過其他靶點通路引起血小板活化，治療效果被減弱。老年AMI患者臨床情況更為復雜，抗血小板治療有效性更需關注[3]。新型抗血小板藥物替格瑞洛為非前體藥，不需要肝臟代謝，具有可與P2Y12 ADP受體可逆性結合，抑制血小板作用較強，可降低急性冠脈綜合征(ACS)患者不良心血管事件風險等優勢。但是，隨著研究的不斷深入，諸多研究證實ACS患者即使服用替格瑞洛，仍然不能避免血栓事件的發生[4-5]，說明仍有一定程度的殘余血小板聚集和活化。因此，尋找參與殘余血小板聚集和活化的關鍵調控分子至關重要。

趨化因子CCL2可由單核細胞、巨噬細胞、血管內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞、心肌細胞等細胞分泌，是炎癥反應中的啟動因子，通過正反饋作用誘導其他炎癥介質的產生和釋放，加速動脈粥樣硬化(AS)的進展[6]。CCL2在ACS的發生發展過程中同樣具有重要作用[7-10]。本研究探討CCL2對老年ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者服用替格瑞洛后殘余血小板活化的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2018年6月至2019年6月于北部戰區總醫院收治的老年STEMI患者80例。所有入選患者年齡>60歲，均有典型胸痛癥狀，發病時間<12 h；心電圖顯示ST段呈弓背向上型抬高、異常Q波、T波倒置及動態演變過程；心肌酶學有動態變化；冠脈造影顯示冠脈三支主要血管中有一處或多處狹窄超過75%。將近期患有嚴重肝腎疾病、腫瘤性疾病、先天性心臟病、心臟瓣膜疾病、自身免疫病、活動性炎癥疾病、血流動力學不穩定、血液系統疾病、嚴重心力衰竭等疾病及既往行心臟冠脈相關手術的個體排除。

1.2 采集臨床資料 入選患者均詳細記錄：入院時間、年齡、性別；常見危險因素：吸煙史、糖尿病病史、高血壓病史；實驗室檢查：空腹血糖(FPG)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、腦尿鈉肽(BNP)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌鈣蛋白T(TnT)等。

1.3 樣本的采集及分組 入選患者服用180 mg替格瑞洛，300 mg阿司匹林腸溶片。之后，分別于服藥后2 h、4 h、6 h抽取患者的靜脈血。每個時間點用含EDTA真空抗凝管采集3 mL靜脈血；用Verifynow配套采血管采集2 mL靜脈血。按照文獻報道，依據Verifynow法檢測P2Y12反應單位(P2Y12 reaction unit，PRU，代表殘余血小板活性)數值不同將患者分為兩組，PRU≥208為高反應組，PRU<208為正常反應組[11]。

1.4 ELISA檢測血漿中CCL2水平 含EDTA真空抗凝管采集的靜脈血，室溫條件下3 000 r/min離心10 min，上清為血漿標本。將血漿標本分裝至EP管中備用，每管100 μL左右。待檢測血漿樣本，加入等量RD6Q液稀釋，充分混勻。反應板每孔先加入50 μL Diluent RD1-83液，再加入200 μL標準品或稀釋后的待測樣本，室溫條件下孵育2 h。棄去液體，反應板每孔加入400 μL Wash Buffer液，洗3次后，將反應板倒置拍干。反應板每孔加入200 μL CCL2 Conjugate液，室溫條件下孵育2 h。棄去液體，反應板每孔加入400 μL Wash Buffer液，洗3次后，將反應板倒置拍干。反應板每孔加入200μL Substrate Solution，室溫條件下避光孵育30 min。反應板每孔加入50 μL Stop Solution，30 min內在酶標儀上檢測吸光度(A)，通道選擇450 nm。繪制標準曲線，并得出公式。將檢測的每個樣本的OD值代入公式，計算出每個待測樣品的濃度。

1.5 Verifynow法檢測P2Y12反應單位(PRU) Verifynow配套采血管采集的人靜脈血于4 h內上機檢測。Verifynow檢測儀使用前預熱15 min，電子質控PASS后，可以檢測。打開檢測儀頂蓋，將測試卡插入儀器中，迅速并輕輕地顛倒血液樣本，充分混勻，將血液樣本采血管倒插入測試卡的檢測針上，關上儀器頂蓋，開始檢測。3～5 min內顯示PRU。

2 結果

2.1 服用替格瑞洛后2 h、4 h、6 h時，兩組患者臨床基線資料及PRU比較 服用替格瑞洛后2 h、4 h、6 h，正常反應組患者分別為49例、65例、68例；高反應組患者分別為31例、15例、12例，殘余血小板高反應比例分別為38.8 %、18.8 %、17.7 %。服藥后不同時間點，正常反應組和高反應組患者臨床基線資料各指標比較，均差異無統計學意義(P>0.05)，見表1～3。

表1 服用替格瑞洛后2 h的STEMI患者基線資料

表2 服用替格瑞洛后4 h的STEMI患者基線資料

表3 服用替格瑞洛后6 h的STEMI患者基線資料

2.2 患者血漿中CCL2濃度的差異及其與PRU的相關性

2.2.1 正常反應組和高反應組患者血漿中CCL2的濃度差異 服藥后2 h高反應組患者血漿中CCL2濃度[(212.10±88.81)pg/mL]明顯高于正常反應組患者[(169.50±36.59)pg/mL]，P<0.01；服藥后4 h高反應組患者血漿中CCL2濃度[(210.00±73.00)pg/mL]明顯高于正常反應組患者[(161.60±40.76)pg/mL]，P<0.01；服藥后6 h高反應組患者血漿中CCL2濃度[(200.00±48.57)pg/mL]明顯高于正常反應組患者[(152.10±44.05)pg/mL]，P<0.01。

2.2.2 患者血漿中CCL2濃度與PRU的相關性 患者服藥后不同時間點血漿中CCL2濃度與PRU之間均存在線性關系(r=0.463，r=0.622，r=0.413，P<0.01，圖1)。

圖1 服用替格瑞洛后不同時間點血漿中CCL2濃度與PRU的相關性：A為服藥后2 h;B為服藥后4 h;C為服藥后6 h

3 討論

AMI發病急，發病率和死亡率呈持續升高趨勢，積極抗血小板治療是目前主要的治療手段之一[12]。然而，由于大部分抗血小板藥物作用機制單一，無法完全拮抗血小板，引起殘余血小板的再次活化和聚集，導致患者發生心腦血管不良事件[13-14]。本研究發現，選擇80例服用替格瑞洛的老年STEMI患者，應用Verifynow法檢測患者服藥后2 h、4 h、6 h的PRU值，均有一定比例的殘余血小板高反應。每個個體血小板反應性不盡相同，其發生心血管終點事件的概率和嚴重程度也不盡相同，具有血小板高反應性的個體更容易發生血小板聚集及激活，發生缺血性事件的概率也要明顯高于血小板正常反應的個體[15]。可見，探尋調控血小板聚集和活化的關鍵因子尤為重要。

趨化因子具有廣泛的生物學效應，可以維持造血環境的穩定，參與胚胎發育、血管新生及炎癥免疫反應等多種生理和病理過程[16-17]。同樣，趨化因子在血栓形成及血栓性疾病中也扮演重要角色[18-19]。血小板是構架血管炎癥和血栓形成必不可少的成分。血小板與趨化因子之間存在著緊密的聯系：血小板可以誘導血液中多種細胞釋放趨化因子；在血小板誘導劑的作用下，趨化因子可以促進血小板聚集、活化和與內皮細胞黏附；激活的血小板可以釋放趨化因子，這些趨化因子可以參與血管生成及脂質代謝等正常生理過程；黏附的血小板可與趨化因子相互結合促使循環中單核細胞到局部發揮作用[20]。

趨化因子CCL2除了具備趨化血液循環中的單核細胞至AS損傷部位，還可以作為始動因子誘導其他炎癥因子和組織因子的產生和釋放，促使AS的進展以及不穩定斑塊破裂所致的血栓形成。我們前期研究發現，STEMI患者服用氯吡格雷4～6 h后，通過光比濁法檢測患者殘余血小板聚集率(RPA)，高反應組患者血漿中CCL2的濃度明顯高于正常反應組，而且患者RPA與血漿中CCL2濃度存在線性相關[21]。本研究發現，80例服用替格瑞洛的老年STEMI患者服藥后2 h、4 h、6 h，高反應組患者血漿中CCL2的濃度均顯著高于正常反應組，各時間點血漿中CCL2濃度與PRU值之間均存在線性關系。而且，高反應組患者臨床基線資料中各項指標均與正常反應組患者相匹配，與各時間點應用Verifynow法檢測的患者PRU值及血漿中CCL2濃度均無相關性，說明PRU值與血漿中CCL2表達水平的相關性未受基線指標等因素的干擾，提示CCL2可能參與了殘余血小板的活化和聚集，并為老年患者血栓事件的預防和治療提供了新思路。