神經突起導向因子-1蛋白在結直腸癌組織中的表達與臨床病理特征及預后的關系

曾群章，韓琳，薛嚇娟，方藝聰

作者單位：福建省漳州市醫院，a結直腸肛門外科，b消化內科，福建漳州363000

結直腸癌是我國第三大常見癌癥，其發病率和病死率持續上升。盡管隨著治療策略的改進，結直腸癌病人的5年生存率在過去30年已從22%提高到47%，但總體生存率仍然不夠理想。目前，根治性手術是最有效的治療方法，但是病程早期癥狀較為隱匿，難以及時診斷與治療，手術切除率不到20%，是結直腸癌病人預后差的主要原因。已有明確的證據顯示，篩查可使結直腸癌的發生率和病死率降低30%～60%。因此，需要更有效的生物標志物預測結直腸癌的預后，并實施分層治療。

神經突起導向因子-1（netrin-1）在胚胎及神經系統發育中發揮軸突導向功能，促進神經細胞遷移。netrin-1除了表達于神經系統外，還在肺臟、視網膜等多種組織器官中表達，在炎癥調節、血管生成、腫瘤進展等方面發揮重要作用。張旭等發現，netrin-1在6種不同來源的結直腸腫瘤細胞中表達上調，尤其以SW620、LOVO、LS174T結直腸癌細胞株最為顯著。但是，netrin-1在結直腸癌臨床樣本中的表達情況尚無報道，因此本研究檢測結直腸癌組織及癌旁正常組織中netrin-1的表達情況，分析其與臨床病理特征及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

根據研究目的，以隨機數字表法選取2012年1月至2014年6月福建省漳州市醫院符合標準的結直腸癌病人共計184例作為研究對象，均行結直腸癌根治術，術中留取癌組織樣本，并選取距腫瘤邊緣5 cm的癌旁正常組織作為對照。納入標準：（1）術后標本經病理學診斷證實為結直腸癌；（2）臨床病理資料完整；（3）首發腫瘤。排除標準：（1）臨床病理特征資料不完整的病人；（2）合并其他腫瘤的病人；（3）術前已接受放化療或生物治療的病人。收集臨床病理資料，包括性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、浸潤深度、分化程度、TNM分期、病理學類型、淋巴結轉移。TNM分期參照第7版（2010）結直腸癌美國癌癥聯合委員會（AJCC）分期標準。所有病人均已簽署知情同意書，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 實驗方法

1.2.1

主要試劑抗netrin-1抗體購自英國Abcam公司；SP-9000通用SP試劑盒、二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒、蘇木精、中性樹膠購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2.2

免疫組織化學染色檢測netrin-1表達將獲得的組織標本用多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片獲得4 μm厚的石蠟切片，常規進行脫蠟、水化、抗原修復等步驟，滴加3%的過氧化氫溶液孵育10 min，然后滴加山羊血清封閉液孵育10 min。滴加抗netrin-1抗體（1∶100），4℃過夜孵育。次日洗滌后，采用SP-9000通用SP試劑盒繼續染色。DAB顯色、蘇木精復染、沖洗、脫水、中性樹膠封片。

1.2.3

結果判斷標準染色結果由2名資深病理醫師雙盲獨立判斷，有分歧的病例，由第3位醫師綜合判斷。將胞質中淡黃色、棕黃色或褐色染色作為陽性細胞，然后根據染色指數進行判斷，染色指數=染色強度積分×陽性細胞比例積分，染色指數包含8個分值，即0、1、2、4、6、8、9、12分，＞4分作為高表達，≤4分則作為低表達。高倍鏡下隨機選取5個視野，觀察染色強度：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，褐色為3分；對陽性細胞與總細胞進行計數，計算比例積分：＜10%為0分，10%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分。

1.3 統計學方法

采用SPSS 21.0進行分析。計數資料比較使用

χ

檢驗，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率比較使用log-rank檢驗，Cox比例風險回歸模型分析預后影響因素。檢驗水準

α

=0.05。

2 結果

2.1 netrin

-

1在結直腸癌組織與癌旁正常組織中的表達情況

免疫組織化學染色結果顯示，netrin-1呈淡黃色、棕黃色或褐色表達于胞質，在癌組織中大部分為高表達，而在癌旁正常組織則不表達或低表達。癌組織與癌旁正常組織中netrin-1高表達率分別為71.7%（132/184）、9.8%（18/184），差異有統計學意義（

χ

=146.255，

P

＜0.001）。

2.2 netrin

-

1表達與臨床病理特征的相關性

netrin-1高表達與浸潤深度（

P

=0.001）、TNM分期（

P

=

0.003

）、淋巴結轉移（

P

＜0.001）有關，而與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、分化程度、病理學類型無關（

P

＞0.05），見表1。

表1 神經突起導向因子-1（netrin-1）表達與結直腸癌184例臨床病理特征的相關性/例

2.3 netrin

-

1表達對病人生存率的影響

netrin-1高表達病人失訪4例，低表達病人失訪2例，隨訪率為96.7%。netrin-1高表達與低表達者5年總生存率分別為40.9%（54/132）和71.2%（37/52），差異有統計學意義（

χ

=15.101，

P

＜0.001）。見圖1。

圖1 神經突起導向因子-1（netrin-1）表達水平與結直腸癌184例總生存率的關系

2.4 5年總生存率的單因素與多因素分析

對結直腸癌病人5年總生存率與各臨床病理特征的關系進行分析，單因素分析結果顯示浸潤深度（

P

=0.027）、TNM分期（

P

=0.002）、淋巴結轉移（

P

＜0.001）、netrin-1表達（

P

＜0.001）與結直腸癌病人5年總生存率相關（見表2）；將該4種因素納入Cox比例風險回歸模型進行多因素分析，結果顯示TNM分期（

RR

=1.768，

P

=

0.023

）、淋巴結轉移（

RR

=1.946，

P

=0.008）、netrin-1表達（

RR

=1.959，

P

=0.039）是結直腸癌病人的獨立預后因素（見表3）。

表2 結直腸癌184例5年總生存率的單因素分析

表3 結直腸癌184例5年總生存率的Cox多因素分析

3 討論

Netrin-1是一種多功能的分泌糖蛋白，在神經發育、血管生成等過程中發揮關鍵作用，因此Ne-trin-1與多種疾病密切相關，包括糖尿病、動脈粥樣硬化、癌癥等。多項研究證實，netrin-1在部分癌癥中表達上調，可阻止其依賴受體結直腸癌缺失蛋白（DCC）和UNC5同源蛋白（UNC5H）誘導的細胞凋亡，如Harter等報道，netrin-1在腦轉移瘤中高表達是病人生存不良的獨立預后因素。因此，對血液或尿液中的netrin-1含量進行檢測已被提議作為癌癥的預測指標，其與其受體相互作用的抑制藥物也已開始研發，一種人源化的抗netrin-1抗體，也被稱為NP137，目前處于I期臨床試驗中。盡管如此，netrin-1在結直腸癌組織中的表達情況及與臨床病理特征及預后的關系尚不清楚。

本研究通過對癌組織及癌旁正常組織進行免疫組織化學染色發現，netrin-1主要表達于細胞質，在癌組織中大部分為高表達，而在癌旁正常組織則不表達或低表達，癌組織中netrin-1高表達率為71.7%（132/184），顯著高于癌旁正常組織9.8%（18/184）。該結果與張旭等在結直腸癌細胞株中發現其表達上調的趨勢一致，提示其高表達可能參與結直腸癌的發生發展。進一步分析netrin-1表達與各臨床病理特征的相關性發現，腫瘤的浸潤深度越深、TNM分期越晚、伴有淋巴結轉移者，netrin-1表達水平越高，表明netrin-1參與結直腸癌細胞的增殖與轉移，但是具體機制仍不清楚。Barallobre等認為，netrin-1可與DCC受體相結合，使其同源二聚體化，從而將caspase-3的剪切位點封閉，抑制該信號通路介導的細胞凋亡。此外，netrin-1還可能通過活化PI3K/AKT信號通路促進人肺腺癌A549細胞與PC9細胞發生上皮間質轉化；netrin-1可與neogenin（neonatal protein，再生蛋白）相互作用，增強CD4T細胞的趨化作用，并引發促炎癥反應，在腫瘤微環境的調節中發揮關鍵作用；netrin-1可以促進血管內皮細胞與平滑肌細胞增生、遷移與黏附，其促血管生成效應可能是腫瘤生長的必要條件。

本研究對病人進行隨訪發現，netrin-1高表達者的5年總生存率為40.9%（54/132）顯著低于低表達者71.2%（37/52）。預后單因素分析結果顯示，浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移、netrin-1表達與結直腸癌病人5年總生存率相關。將這4種有統計學意義的因素納入Cox多因素分析，結果表明TNM分期、淋巴結轉移、netrin-1表達是結直腸癌病人的獨立預后因素。因此，netrin-1表達有可能成為結直腸癌病人預后評價的生物學指標，也為機制研究與藥物開發提供了一個新的作用靶點。

本研究的不足與展望：（1）netrin-1的依賴性受體DCC與UNC5C也在多種腫瘤中異常表達，與腫瘤病人預后密切相關，但是本研究未對netrin-1的受體進行檢測，未來需要進一步探討其受體的表達情況及與臨床病理特征、預后的關系；（2）本研究通過對臨床組織進行病理染色分析netrin-1的表達情況，但是有研究發現，netrin-1在腫瘤病人的血漿中也存在差異性表達，而血漿較組織樣本病理檢測具有取材簡單便捷等優勢，對于早期診斷具有更重要的臨床意義，因此后續仍需要從血漿表達的角度進一步完善本研究結論；（3）netrin-1促進結直腸癌發生發展的機制仍未探討，未來需要進一步在體外細胞培養與移植瘤動物模型中深入研究，通過基因敲除、RNA干擾、蛋白阻斷等方法揭示netrin-1的上下游調節通路。

綜上所述，netrin-1在結直腸癌組織中表達升高，其高表達可能參與結直腸癌的發生發展，對預后判斷有一定的參考價值。