基于MS2蛋白系統的可移動性RNA鑒定方法

李陸萍，鄧竹英，汪志鵬，梁大成

(1.湖北省主要糧食作物產業化協同創新中心，湖北 荊州 434025；2.長江大學濕地生態與農業利用教育部工程研究中心，湖北省澇漬災害與濕地農業重點實驗室，湖北 荊州 434025)

植物中有些RNA分子可以通過胞間連絲或植物韌皮部進行長距離移動。在外界環境刺激下，這些可移動的RNA在源(Source)中轉錄，然后通過韌皮部運輸到庫(Sink)中并發揮作用[1-4]。目前發現3類可移動的RNA分子存在于韌皮液內，外源類病毒或RNA病毒，植物內源mRNA以及非編碼小RNA[5]。植物病毒侵入寄主細胞后，通過胞間連絲和韌皮部篩管分別實現細胞間轉運和長距離轉運，從而對植物系統實現侵染[6]。病毒RNA是最早被證實可以在植物韌皮部進行長距離運輸的RNA，其在韌皮液的運輸機制為研究植物內源mRNA提供了重要參考。通過對植物韌皮液轉錄組分析發現了數千種mRNA，它們所編碼的蛋白質參與信號轉導等功能[7-8]。然而并非所有韌皮液中發現的RNA均進行長距離移動。目前已在嫁接植物體中發現了些許可移動mRNA，研究表明，這些長距離運輸的mRNA可以作為信號分子對植物的生長發育進行調控[9-12]。最近的一項研究通過大豆和菜豆的異緣嫁接試驗證明，地上部產生的很大一部分小RNA被運輸到根部，然而mRNA在地上部和根部之間的移動非常有限，推測小RNA才是遠程通信的“信使”[13]。盡管越來越多的試驗表明，可移動RNA分子可作為活躍的信號分子在細胞間轉移，但目前對可移動RNA運輸的機制了解有限。因此，移動的RNA是如何轉移到其他細胞當中還仍待研究。

在RNA實時成像系統中，利用熒光標記的RNA結合蛋白(RNA-binding proteins，RBPs)進行間接RNA標記[14-15]。利用GFP融合MS2噬菌體外殼蛋白(MS2-GFP)，將目標RNA融合到MS2識別RNA莖環(Stem loop，SL)的串聯重復序列上，MS2-GFP與RNA-SL之間的相互作用可以使活細胞中的RNA可視化。利用來自猿猴病毒40(Simianvirus40，SV40)的核定位信號(Nuclear localization signal，NLS)將MS2-GFP限制在細胞核上，減少了來自MS2-GFP的胞質熒光背景，當MS2SV40-GFP與含有SL的RNA共表達時，MS2SV40-GFP與其RNA識別位點相連，RNA-蛋白復合物被保留在細胞質中從而形成熒光。該系統已成功應用于酵母、果蠅、哺乳動物和植物中mRNA的可視化[16-21]。然而來自SV40的NLS無法有效地將小的GFP融合蛋白限制在細胞核上，導致少量MS2SV40-GFP蛋白在細胞質中積累[22-23]。然而該系統在植物中使用時通常會在細胞質中產生大量的熒光背景，極大地干擾了RNA信號的檢測。后來對MS2系統進行改進，用一種特異定位于擬南芥頂端分生組織細胞核的轉錄因子FD替代SV40作為核定位信號，大大減少了細胞質熒光背景[24-26]。本研究構建了含有RNA莖環串聯重復結構的表達載體pSL24UbiK，基于MS2FD-GFP的RNA標記系統，噬菌體外殼蛋白MS2與RNA莖環串聯重復結構識別，共聚焦顯微鏡觀察GFP信號的亞細胞定位情況，可以鑒定RNA的可移動性，為今后可移動RNA的研究奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

野生型擬南芥(Col-0)和野生型本生煙草(Nicotianabenthamiana)均由長江大學農學院濕地作物微嫁接實驗室提供，大腸桿菌DH5α、根癌農桿菌GV3101由本實驗室保存。質粒p1390-35S-MS2FD-GFP、p1390-35S-FT-SL24由“臺灣”中央研究院植微所余天心博士提供，限制性內切酶MfeⅠ、EcoRⅠ購于 New England Biolabs公司。本研究所用引物均由生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 pSL24UbiK表達載體的構建 利用引物SL24F1：TGATTAACAGCTCGCGGGCCCAAGCCCTAGGTAATACGACTCACTATAGG和SL24R1：CTTACTCAGTTAGGTCAATTGCACACTCGAGAATTAACCCTCACTAAAGG 從pCR4-24xMS2SL-stable質粒中擴增出含有SL24序列的片段，將該片段連入雙元載體pUbiK，轉化 DH5α感受態細胞，挑取單克隆菌株擴繁，提取質粒，經酶切鑒定，并在測序結果比對正確后，最終得到pSL24UbiK載體。

1.2.2 RNA提取及cDNA合成 取幼嫩的野生型擬南芥葉片剪碎放入液氮預冷的研缽中，加入適量液氮，充分研磨后采用TRIzol法提取RNA，RNA的濃度通過Nano Drop 2000(Thermo)測定，質量和完整性通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。用反轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈的合成。

1.2.3 基因克隆 提取擬南芥DNA，以DNA為模板，對GUS基因進行PCR擴增；以上述合成的cDNA作為模板，對FT(FLOWER ING LOCUS T)基因進行CDS 全長序列的擴增(表1)。PCR反應程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，59 ℃/ 60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃總延伸5 min，4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢驗，然后將PCR產物用純化試劑盒進行回收。pSL24UbiK經限制性內切酶MfeⅠ 37 ℃反應2 h后純化備用。利用同源重組酶將克隆的2個基因片段分別連接到線性化載體pSL24UbiK上。取5 μL重組產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取單克隆菌株擴繁，提取質粒，經酶切(EcoR Ⅰ)鑒定，由公司測序。在測序結果比對正確后，最終得到pSL24UbiK-GUS和pSL24UbiK-FT載體。將構建好的質粒轉化農桿菌 GV3101。

表1 本研究中用到的引物Tab.1 Primer sequence used in this research

1.2.4 煙草葉片的瞬時表達及共聚焦激光顯微鏡成像 將含重組質粒的農桿菌500 μL加入至含有抗生素的20 mL LB液體培養基中，28 ℃過夜振蕩培養5 000 r/min離心10 min，收集菌體倒掉上清液，用無菌水重懸菌體，使菌液濃度分別達到OD600≈0.3。將pSL24UbiK-FT和p1390-35S-MSFD-GFP、pSL24UbiK-GUS和p1390-35S-MS2FD-GFP、p1390-35S-FT-SL24和p1390-35S-MS2FD-GFP的菌液分別等體積混勻，選取葉齡在35 d左右的本氏煙草，用2 mL注射器(去掉針頭)在葉片背部注射菌液直至葉片組織空隙被液體填滿，而后將注射后的煙草放置于25 ℃條件下培養，48 h之后用水將侵染過的煙草葉片清洗一遍，從侵染的葉片區域取出約0.5 cm2的樣品制片，在Leica激光共聚焦顯微鏡TCS-SP8下對熒光信號(GFP)進行觀察，激發光波長選擇488 nm。

2 結果與分析

2.1 FT、GUS基因擴增

使用引物GUS-F/R、FT-F/R，對目的基因進行序列擴增，得到了大小符合、條帶清晰且單一的PCR條帶，其中GUS基因長度為430 bp；FT的CDS全長為675 bp(圖1)。

A.GUS；B.FT；M.DL10000 DNA Marker。

2.2 表達載體的構建

重組產物轉化DH5α感受態細胞后，在抗性培養基上挑選陽性菌落進行質粒提取，經EcoRⅠ酶切pSL24UbiK、pSL24UbiK-FT、pSL24UbiK-GUS質粒結果如圖所示(圖2)。條帶大小符合預期，初步判定pSL24UbiK、pSL24UbiK-FT、pSL24UbiK-GUS表達載體構建成功。送樣測序后，通過序列比對，進一步確認表達載體構建成功。

A.pSL24UbiK經EcoR Ⅰ 酶切后產生的7 363,2 606,1 328,706 bp大小的片段; B.pSL24UbiK-FT經EcoR Ⅰ 酶切后產生的7 363,3 281,1 328,706 bp大小的片段; C.pSL24UbiK-GUS經EcoR Ⅰ 酶切后產生的7 363,3 036,1 328,706 bp大小的片段; M.Trans2K Plus DNA Marker。

2.3 MS2FD-GFP的亞細胞分布

瞬時表達的GFP或MS2-GFP在細胞核和細胞質中均有定位，雖然將SV40 NLS插入到MS2-GFP(MS2SV40-GFP)中大大降低了MS2-GFP的細胞質背景，但仍然可以檢測到的MS2-GFP細胞質背景，極大干擾了信號的檢測[26]。將改造后的含有p1390-35S-MS2FD-GFP的農桿菌侵染煙草葉片，48 h后用倒置熒光顯微鏡觀察到MS2FD-GFP定位在細胞核中(圖3)，與MS2SV40-GFP相比大大減少MS2-GFP的細胞質背景影響，為后續試驗的驗證提供了良好的支撐依據。

圖3 MS2FD-GFP的亞細胞定位Fig.3 Subcellular localization of MS2FD-GFP

2.4 可移動RNA FT的亞細胞分布

在本氏煙草葉片中，通過農桿菌滲透法將p1390-35S-FT-SL24與p1390-35S-MS2FD-GFP共侵染煙草葉片，MS2FD-GFP可與FT-SL24融合，在細胞核和胞質中均檢測到GFP信號，并在細胞質附近顯示出點狀信號(圖4)。與此同時，將成功構建的pSL24UbiK-FT與p1390-35S-MS2FD-GFP共侵染煙草葉片，發現與對照試驗中p1390-35S-FT-SL24與p1390-35S-MS2FD-GFP共侵染結果一致(圖4)。

圖4 植物細胞中可移動RNA的亞細胞分布Fig.4 Subcellular localization of mobile RNA in plant cells

2.5 不可移動RNA GUS的亞細胞分布

為了解釋可移動RNA在細胞質附近檢測出的點狀信號，將不可移動RNAGUS融合載體pSL24UbiK上，將pSL24UbiK-GUS與p1390-35S-MS2FD-GFP共侵染煙草葉片，48 h后用倒置熒光顯微鏡觀察細胞中 GFP 的表達以及位置。結果發現，不可移動RNAGUS在細胞質附近沒有檢測到熒光信號，只在細胞核位置有熒光信號的出現(圖5)。由此可以看出，通過將RNA融合到pSL24UbiK載體上經過該系統檢測，若在細胞質附近檢測到熒光信號則說明該RNA是可移動的，反之亦然。

圖5 共聚焦顯微鏡下觀察植物細胞中移動RNA和非移動RNA的亞細胞分布差異Fig.5 The subcellular distribution difference of mobile RNA and non-mobile RNA in plant cells was observed under confocal microscopy

3 結論與討論

可視化活細胞內RNA的實時運輸是了解特定RNA細胞分布最有效的方法。在這些方法中，通過基因編碼的熒光RBP進行間接RNA標記使特定組織中的RNA可視化[14-15，27]。盡管許多物種在RNA實時成像方面取得了顯著進展，但在植物中的研究相對有限[15，28]。另外，依賴于MS2的RNA可視化系統的缺點之一是需要在目標RNA上多次重復MS2識別的SL結構。檢測活植物細胞中的熒光信號至少需要重復24個SL序列，這與哺乳動物細胞的結果一致[29]。在目標RNA上插入大片段的MS2識別SL序列(SL序列的24個重復序列為870 bp)可能會干擾目標RNA的生物學功能。實時RT-qPCR和共聚焦顯微鏡分析表明，在目標FTRNA上插入SL序列不會極大地干擾RNA的轉錄和翻譯[26]。但是，不排除在其他RNA上插入SL序列導致其功能破壞的可能性。FTRNA在光周期誘導的葉片中轉錄翻譯，并且可以從葉片向莖尖移動，調控光周期敏感植物開花，可被作為典型的可移動的RNA進行研究[30-31]。本研究構建了含有24個莖環串聯重復的RNA結構表達載體pSL24UbiK，利用不可移動RNAGUS作為陰性對照，觀察了可移動RNA和不可移動RNA在細胞中的定位情況，驗證了該方法的可行性，為今后研究可移動RNA的運輸奠定了基礎。

植物韌皮液內RNA分子長距離移動的發現具有重要意義，可移動RNA作為植物調控模式中的新信號，是植物界研究的新熱點。目前，雖然已知植物韌皮液內存在上千種RNA，但是能進行長距離移動的只有小部分被驗證，且明確功能的更少，對于其運輸調控機制也僅停留在假說階段。本鑒定方法可以快速驗證RNA分子是否可以移動，避免了傳統的復雜驗證過程，極大地提高了工作效率，為科研人員節省了大量的時間和精力。