擬南芥轉錄因子AtOFP19功能的初步研究

韓佳良，王鶴萌，張冬瑞，常 纓

(東北農業大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150036)

轉錄因子(Transcription factors)是一種具有特殊結構的蛋白質，通過與其他蛋白質復合物的特定序列或DNA的特定序列結合來調控基因的表達[1]，也稱作反式作用因子。植物中的轉錄因子分為2種，一種是非特異型轉錄因子，它們非選擇性地調控基因的轉錄表達，還有一種稱為特異型轉錄因子，它們能夠選擇性調控某種或某些基因的轉錄表達。

通過對番茄的一系列遺傳研究發現，番茄的果實形狀是由一個單隱性數量性狀位點(QTL)控制的[2]。這個基因位點可以控制番茄的果實形狀由圓形變成梨形[3]，該位點被命名為梨形(pr)位點。后來發現pr與控制果實由扁圓形變為橢圓形的位點是等位的，因此又將該位點命名為卵形(o)位點[4]。2002年，Liu等[2]對該位點進行了測序和精細的定位分析，將卵形基因縮小到一個包含8個開放閱讀框(ORFs)的55 kb片段中。對基因編碼的蛋白質氨基酸序列進行分析，發現蛋白的羧基端有一個70 aa的結構域，被稱為OVATE結構域，含有該結構域的蛋白質被指定為OVATE家族蛋白，也叫作卵形家族蛋白(OFPs)，這個結構域在水稻和擬南芥中都是保守的。OVATE蛋白包含2個結構域，一個是假定的核定位信號(NLS)，另一個是Von Willebrand類型C因子 (VWFC)結構域，這兩個結構域是蛋白質與蛋白質相互作用所必需的。通過這些特征將OVATE蛋白與之前所確定的植物轉錄因子區分開[2]。

迄今為止，OFPs主要在擬南芥中表現出來，AtOFPs是一類新型的，植物特有的轉錄因子，并被證明與植物的生長發育相關[5]。現有研究表明，AtOFP1會導致植物的地上器官包括下胚軸、蓮座葉、莖生葉的長度均有所減少[6]；AtOFP4會抑制表皮細胞伸長[7]。2011年，Wang等[8]發現在擬南芥中有18個基因被預測編碼卵形蛋白。但在2014年Liu等[9]發現2個以前未發現的AtOFP，At2g36026(命名為AtOFP19)和At1g06923(命名為AtOFP20)。由于AtOFP9失去了卵形家族蛋白典型的OVATE結構域，所以AtOFP9被從擬南芥卵形家族蛋白中剃除，因此，擬南芥卵形蛋白家族成員由原來的18個變為現在的19個，這些基因分布在5條染色體上。

植物激素是存在于植物體內的有機小分子[10]，在植物生長發育各個時期均有作用，包括植物種子發芽、開花、結果、植物體的生長以及植物體凋零階段[11]。當植物面對不利的環境因素時，細胞會從舒適狀態變為脅迫響應狀態，這一系列的生理狀態變化主要取決于對脅迫狀態信號的感知、轉錄因子的活化、激素的變化等一系列過程[12]。現研究表明，植物激素對蘿卜中的RsOFP2.3的表達有影響[13]，表明RsOFP2.3受到激素的調控進而影響植物的生長發育。

目前為止，對AtOFPs中其他AtOFP的功能已有了深入的研究，但對新發現的AtOFP19基因的研究知之甚少。本試驗基于TAIR網站上的信息對AtOFP19基因進行初步分析，并利用生物信息學對AtOFP19蛋白結構、保守結構域進行分析，還完成了轉錄活性、亞細胞定位、激素處理等試驗，對AtOFP19基因功能進行初步研究，對后續研究AtOFP19基因功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 植物材料

選用哥倫比亞(Col)野生型擬南芥種子，訂購于ABRC(Arabidopis Biological Resource Center)的T-DNA插入突變體(atofp19)。

1.2 試驗方法

1.2.1AtOFP19基因的生物信息學分析 應用TAIR數據庫查詢基因的基本信息。用NCBI進行保守結構域分析。應用ExPASy數據庫對蛋白質初級結構進行分析。蛋白質二級結構預測、蛋白質三級結構預測分別應用SOPMA、SWISS-MODEL軟件。使用SignalP軟件分析信號肽。亞細胞定位預測采用最新的擬南芥亞細胞定位預測網站SUBA4軟件[14]。網站鏈接見表1。

表1 生物信息學網站Tab.1 Bioinformatics website link

1.2.2 擬南芥的種植與培養 將約100粒擬南芥種子放入干凈的2 mL EP管中，加入1 mL 30% 84消毒液，放入搖床中室溫振蕩15～20 min。用蒸餾水清洗消毒過的擬南芥種子，連續清洗4次盡量保證將消毒液清洗完全。用移液器把種子均勻點在固體培養基中，將種子鋪勻。密封，避光放入4 ℃冰箱培養48 h。將培養后的種子放在組培架上用垂直光照進行培養。7～10 d后，用鑷子把擬南芥幼苗移種到土壤中，每2 d澆水一次。

1.2.3AtOFP19基因克隆 采用植物總RNA提取試劑盒(北京擎科新業生物技術有限公司)提取擬南芥總RNA，利用HiScript Ⅱ Q Select RT SuperMix for qPCR(南京諾唯贊公司)進行反轉錄。以擬南芥cDNA第一鏈為模板，進行PCR擴增，擴增體系為20.0 μL：2×Taqmix 酶，上下游引物各 1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 7 μL。擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環。進行瓊脂糖電泳驗證PCR產物，連接PUC載體，轉化大腸桿菌進行擴增，挑選3個陽性克隆菌液送至庫美生物技術有限公司測序。

1.2.4 35S∶HA-AtOFP19轉基因植株的獲得 選擇XbaⅡ、BamH Ⅰ酶切位點用限制性內切酶酶切pBI121載體，對載體進行線性化。利用ClonExpress One Step Cloning試劑盒將目的基因與載體連接。引物設計的總原則：通過在引物5′端引入同源序列，使擴增產物之間以及擴增產物與線性化克隆載體之間都具有能夠相互同源重組的完全一致的序列。插入片段PCR擴增，使用高保真聚合酶進行擴增。通過農桿菌介導法浸染擬南芥，具體步驟參考蔡玲[15]的研究。將浸染后的植株，用蓋子蓋好(不透光)室溫避光一夜，第2天拿到培養架上，正放培養。將擬南芥植株轉化后得到的第1批種子稱為T1。將滅菌后的T1種子種到含有Kan(50 mg/mL)抗性的1/2MS固體培養基中，篩選出綠色幼苗，移到土壤中培養。收集T1植株的種子稱為T2，按照上述步驟重復操作，得到純合35S∶HA-AtOFP19轉基因植物。

1.2.5 亞細胞定位的觀察 構建pCAMBIA1302-AtOFP19-GFP載體，通過原生質體瞬時轉染技術[16]將載體轉入到原生質體中，在遮光室溫條件下孵育16 h，用移液器將少量的原生質體溶液滴加在載玻片上，由一端輕輕地將蓋玻片蓋到載玻片上，要盡量避免產生氣泡。在蓋玻片的表面滴加少量的鏡油，選擇GFP激發光，利用激光共聚焦顯微鏡觀察亞細胞定位情況，并拍攝記錄。

1.2.6 熒光定量試驗 熒光定量試驗采用全式金公司熒光定量試劑盒，以β-Actin為內參，進行熒光定量PCR，每次試驗進行3次生物學重復(表2)。

1.2.7 AtOFP19對種子萌發的影響 將WT種子、OE種子、atofp19種子，用30% 84消毒液消毒10 min，無菌水漂洗5～6次。將3種種子接種到無激素無抗性1/2MS培養基上，每個平板中接種100粒種子，4 ℃春化2 d，然后轉移到培養箱中進行培養。以胚根突破種皮為萌發標志，每天統計萌發率，連續統計7 d。相同的試驗進行3次，然后對數據進行分析。

表2 熒光定量體系Tab.2 Fluorescence quantitative system

1.2.8 激素調控AtOFP19基因的表達量 將野生型擬南芥種子接種到含不同濃度脫落酸ABA(0.2，0.5，1.0 μmol/L)、細胞分裂素6-BA(0.5，1.0，2.0 μmol/L)、赤霉素GA3(0.5，1.0，2.0 μmol/L)、生長素IBA(0.5，1.0，2.0 μmol/L)和乙烯利ETH(0.2，0.5，1.0 μmol/L)的1/2MS培養基上，以不添加激素處理為對照，選取最適濃度培養基中的幼苗移到土壤里培養，qRT-PCR測定AtOFP19基因的相對表達量，每個處理進行3次生物學重復。

2 結果與分析

2.1 AtOFP19基因生物信息學分析

2.1.1AtOFP19基因的分析 在已發表的文獻中可查詢AtOFP19基因的基因號為AT2G36026.1。在TAIR網站上查詢AtOFP19基因的基本信息。可知，AtOFP19基因全長552 bp，CDS區552 bp，無內含子，位于第2號染色體。

2.1.2 AtOFP19保守結構域分析 應用NCBI對AtOFP19保守結構域分析發現，作為AtOFPs中的一員，AtOFP19蛋白在C末端有一個OVATE保守結構域(圖1)，與家族中其他成員一樣擁有OVATE蛋白家族特征結構域，并且除了這個結構域外，AtOFP19蛋白中未預測到其他已知的結構域。

2.1.3 AtOFP19蛋白初級結構分析 對AtOFP19蛋白質理化性質進行分析，AtOFP19蛋白由183個氨基酸組成，AtOFP19蛋白的分子式為C892H1386N260O272S8，分子量為20.36 ku，理論等電點為9.32(圖2)。

通過對AtOFP19基因編碼的氨基酸進一步分析發現，AtOFP19蛋白質由19種氨基酸組成，其中Ser含量最多，占氨基酸總數的17.5%，Leu、Lys、Ala次之，Trp含量最少，僅占氨基酸總數的1.1%。帶正電荷的氨基酸殘基 (Asp+Glu)總數為16個，帶負電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)總數為23個(圖3)。

圖1 AtOFP19保守結構域分析Fig.1 Analysis of conserved domains about the AtOFP19 protein

圖2 AtOFP19蛋白初級結構分析Fig.2 Analysis of AtOFP19 protein primary structure

圖3 AtOFP19蛋白氨基酸組成分析Fig.3 Amino acid composition analysis of the AtOFP19 protein

2.1.4 AtOFP19蛋白二級及三級結構分析 運用SOPMA對AtOFP19編碼的蛋白質進行二級結構分析，在AtOFP19蛋白中，無規卷曲 (Random coil)含量最多，占48.09%，是AtOFP19蛋白質二級結構的主要構成元件；α螺旋 (Alpha helix)和延伸鏈 (Extended strand)次之，分別占28.96%，18.03%，β轉角 (Beta turn)最少，占4.92%(圖4)。

利用SWISS-MODEL軟件預測AtOFP19蛋白的三級結構，對AtOFP19的三級結構進行分析，結果顯示AtOFP19蛋白質三級結構中構成元件與二級結構預測結果基本一致(圖5)。

2.1.5 AtOFP19蛋白信號肽分析 應用SignalP在線分析軟件對AtOFP19蛋白編碼的氨基酸進行信號肽預測，結果顯示，在N端前70個氨基酸中，最大的S值為0.003 8，推測AtOFP19蛋白不具有信號肽，是非分泌蛋白(圖6)。

2.1.6 AtOFP19蛋白亞細胞定位分析 AtOFP19是轉錄因子OVATE家族中的一員，應用最新的擬南芥亞細胞定位預測網站SUBA4對其進行亞細胞定位預測，結果顯示，AtOF19蛋白被預測定位在細胞核中(圖7)。

Hh.α螺旋；Ee.延伸鏈；Tt.β轉角；Cc.無規卷曲。Hh.Alpha helix；Ee.Extended strand；Tt.Beta turn；Cc.Random coil.

圖5 AtOFP19蛋白三級結構分析Fig.5 Analysis of AtOFP19 protein tertiary structure

圖6 AtOFP19蛋白信號肽分析Fig.6 Signaling peptide analysis of AtOFP19 protein

圖7 AtOFP19蛋白亞細胞定位分析Fig.7 Subunit localization analysis of AtOFP19 protein

2.2 AtOFP19基因的克隆

提取擬南芥總RNA，反轉錄得到cDNA。以cDNA為模板，利用PCR技術克隆得到AtOFP19基因。PCR產物大小在550 bp左右，與生物信息學分析結果一致(圖8)，并通過基因測序分析驗證了得到的目的片段為AtOFP19基因。

2.3 AtOFP19亞細胞定位分析

將構建帶有GFP信號的載體轉入擬南芥原生質體中，通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察熒光分布情況。結果如圖9所示，AtOFP19-GFP融合蛋白只在細胞核中表達，說明AtOFP19蛋白定位在細胞核中。

M.Marker；M1、M2、M3. AtOFP19基因條帶。M.Marker；M1，M2，M3. AtOFP19 gene.

A.綠色熒光；B.明場；C.疊加。A. Fluorescence；B.Normal light；C.Merged.

2.4 AtOFP19基因表達分析

2.4.1AtOFP19基因組織表達分析 取生長到35 d左右的擬南芥為材料，利用qRT-PCR對AtOFP19基因在擬南芥各部位表達量進行分析。結果表明，AtOFP19基因在根、莖、葉、花、角果中均有表達，在莖生葉和花中的表達量相對較高，其中在花中的表達量最高，在角果、根、莖中的表達量較少。這些結果表明，AtOFP19基因在擬南芥花和莖生葉的形成過程中起作用(圖10)。

不同小寫字母表示0.05水平差異顯著性。圖11，12，15同。Different lowercase letters indicate significant differences in 0.05 levels.The same as Fig.11，12，15.

2.4.2AtOFP19基因在不同發育時期表達分析 每隔10 d取WT植株為材料，進行qRT-PCR測定AtOFP19基因的相對表達量。結果表明，AtOFP19基因在擬南芥幼苗生長初期階段(10 d)表達量較高，隨著植物的生長發育AtOFP19基因的表達量下降，到開花時期(50 d)表達量又升高(圖11)。這暗示著AtOFP19基因在擬南芥幼苗生長階段與植株開花階段起作用。

圖11 AtOFP19基因在不同時期的表達量

2.5 AtOFP19是轉錄抑制子

構建PUC-GD-AtOFP19載體，以LD-VP16、GD、GD-AtOFP19為效應基因，Lex-Gal4∶GUS為報告基因共同利用瞬時轉染技術，轉到原生質體中，檢測GUS的相對表達量，來檢測其轉錄活性。已知LD-VP16是轉錄激活子，它能夠激活報告基因的表達，因此將GD、LD-VP16和報告基因Lex-Gal4∶GUS共轉染到原生質體中，報告基因GUS表達量會高表達。結果表明，GD-AtOFP19、LD-VP16和報告基因Lex-Gal4∶GUS的試驗組中GUS表達量較對照組低(圖12)。因此，證明了AtOFP19具有轉錄抑制活性。

圖12 AtOFP19為轉錄抑制子Fig.12 AtOFP19 is a transcriptional repressor

2.6 35S∶HA-AtOFP19轉基因植株、atofp19突變體植株與野生型植株表型對比

將構建的pBI121-HA-AtOFP19載體利用農桿菌浸染技術轉入野生型植株中，篩選得到2株純合OE植株(OE1、OE2)。將OE、atofp19與WT的表型進行對比，發現WT與atofp19的表型沒有明顯差異，而與WT相比，OE植株蓮座葉較小，莖細，植株整體細小(圖13)。

A.野生型植株；B.atofp19轉基因植株；C.OE轉基因植株。A. Wild type plants；B. atofp19 mutant plants；C.OE transgenic plants.

2.7 AtOFP19抑制種子萌發

種子休眠和萌發受到種子內部生長物質的調控和外部環境因子的影響，是一個十分復雜的生理過程。為研究AtOFP19是否在擬南芥種子萌發過程中起作用，本試驗將OE、atofp19與WT的種子種到無激素無抗性的1/2MS培養基中，統計1～7 d種子萌發率。結果表明，當培養4 d后種子萌發率基本穩定。與WT植株種子的萌發率相比，OE植株種子萌發率較低，而atofp19植株種子萌發率較高(圖14)，表明AtOFP19對擬南芥種子的萌發具有抑制作用。

圖14 種子萌發率Fig.14 Seed germination rate

2.8 AtOFP19基因受6-BA激素的調控

為探究AtOFP19基因的表達是否受到激素的調控，將WT種子接種到含不同濃度 ABA、6-BA、GA3、IBA和ETH的1/2MS培養基上，以不添加激素為對照，篩選出生長狀況較好的幼苗移到土壤里培養，利用qRT-PCR測定AtOFP19基因的相對表達量。結果如圖所示，6-BA處理組中的AtOFP19基因表達量最高。而ABA、GA3、IBA處理組植株中的AtOFP19基因表達量與對照組的無顯著差異(P>0.05)(圖15)，表明AtOFP19基因的表達主要受6-BA的調控。

圖15 激素處理后AtOFP19基因相對表達量

3 討論

2011年Wang等[8]為研究AtOFPs在植物生長發育中發揮的作用，利用生物信息學、生物化學、分子生物學、遺傳學表型觀察等方法對擬南芥AtOFP基因進行了分析。觀察過表達AtOFPs植物的表型發現AtOFP1、AtOFP2、AtOFP4、AtOFP5和AtOFP7過表達的植物表型為腎形子葉和圓形、卷曲的葉子，花發育遲緩，蓮座葉較小，結實率下降，將這幾個基因歸為Ⅰ類AtOFP基因。過表達AtOFP6和AtOFP8的植物表型為扁平、厚的青色蓮座葉，歸為Ⅱ類AtOFP基因。過表達AtOFP13、AtOFP15、AtOFP16和AtOFP18的植物表型相似，為蓮座葉較小，結實率降低，花發育延遲，角果末端鈍平，歸為Ⅲ類AtOFP基因[8]。本試驗成功地獲得了過表達AtOFP19植株，其表型為蓮座葉較小，莖細，植株矮小，與Ⅲ類基因的表型相似。

在2007年發現了AtOFP1是轉錄抑制因子，在植物細胞伸長過程中起抑制作用[6]。2011年Li等[5]發現過表達AtOFP2、AtOFP7的植株表型與過表達AtOFP1的植株表型相似，通過試驗證實了AtOFP2、AtOFP7也是轉錄抑制因子。在此之后Wang等[8]證實了其他AtOFPs也是轉錄抑制因子，這表明AtOFPs可能是一個新的轉錄抑制因子家族。本試驗通過構建PUC-GD-AtOFP19載體，利用原生質體瞬時轉染技術，將構建的載體轉入原生質體中，酶標儀測定試驗組和對照組的GUS相對表達量，發現試驗組中GUS表達量較對照組低，驗證了AtOFP19也是轉錄抑制子。

MYB類轉錄因子是植物體內最大的轉錄因子家族之一，MYB類轉錄因子會通過多種途徑參與植物對干旱脅迫、高溫脅迫、低溫脅迫、重金屬脅迫、鹽脅迫的響應[17-19]，同時MYB轉錄因子對植物體內的激素具有調節作用[20]。現研究表明，植物激素對蘿卜中的RsOFP2.3的表達有影響，在12 h內，RsOFP2.3的表達對ABA、NAA、6-BA和GA3的反應顯著上調，并且對GA3處理最敏感，其次是6-BA、ABA和NAA，而在處理12，24 h后對乙烯的反應均無明顯變化，這表明RsOFP2.3受到激素的調控進而影響植物的生長發育[13]。那么擬南芥中的轉錄因子AtOFP19是否也受到植物激素的調控，本試驗發現AtOFP19的表達量受到6-BA的調控，而其他激素對AtOFP19表達量的調控沒有明顯作用，這暗示著AtOFP19基因主要受到6-BA激素的調控進而影響植物的生長發育，其調控的分子機制還需要進一步試驗探究。